آلودگی های زیست محیطی و مواد شوینده

دانلود پایان نامه

مقدمه
استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسمها مستلزم ترشح آنزیمهای هیدرولازی است که مهمترین آنها کوتیناز میباشد. کوتیناز توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلیاسترهای کوچک را داراست. کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه میکند. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارد و دارای ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب است [1]. کوتین یک پلی استر بسیار هیدروفوب غیر محلول در آب و از مشتقات گاما هیدروکسی اسیدچرب میباشد که در ساختار کوتیکول گیاهان وجود دارد [2]. اصطلاح کوتین از کوتوس گرفته شده و این اصطلاح در اصل برای توصیف مادهای است که بخشی از اپیدرم برگ را تشکیل داده و در برابر اسیدهای قوی مقاوم است. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارند. مطالعات بر روی کوتین و کوتیکول گیاه از قرن نوزده آغاز شده است. حتی گیاهان عالی که در زیر آب زندگی میکنند مانند چمندریا، زئوسترا مارینا دارای کوتین هستند و مونومرهایی از همان نوع مونومرهایی که در بقیهی گیاهان یافت میشود دارند.کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلیاستری هیدروکسی و اپوکسیاسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافتهاند[3]. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 بوده و دارای یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقشی کلیدی در حفاظت از گیاه در برابر عوامل بیماریزا ایفا میکند [4] و تجزیهی آنزیمی آن یکی از اولین گامها در فرآیند آلودگی است. در واقع کوتیکول یک لایهی محافظ چربیدوست است که برگها، ساقهها و میوهها را میپوشاند. بر روی کوتیکول لایهای از موم پوشیده شده است که علاوه بر اینکه مانع از تبخیر آب گیاه میشود در برابر عوامل بیماریزا و آفات نیز از گیاه حفاظت میکند. استفاده از آنزیم کوتیناز باعث افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی کشاورزی شده و همچنین کوتیناز به عنوان یک آنزیم لیپولیتیک در مواد شوینده لباس و ظرف برای چربی زدایی به کار رفته است. تجزیهی پلاستیکها از قبیل پلیاسترهای مصنوعی، محصولات محلول در آب با استفاده از کوتیناز بدست آمده است.
اهمیت و ضرورت تحقیق
با توجه به ویژگی ها خاص آنزیم کوتیناز و کاربردهای ان در صنعت و بیوتکنولوژی و نیز چشم انداز روشن در فرایند تجزیه پلاستیک و الاینده های پلی استری موجود در طبیعت، یافتن انزیمی با شرایط مطلوب تر همواره مورد توجه بوده است. آنزیمهای کوتیناز در باکتریها و قارچها مطالعه شدهاند اما آنزیم های کوتیناز گونه های باکتریایی تا کنون به میزان کمتری مورد بررسی قرار گرفته اند.
امروزه یافتن آنزیمهایی با خصوصیات جدید و ویژگیهای مطلوبتر که از نظر صنعتی و پزشکی اهمیت دارند یکی از زمینه های مهم پژوهشی در علوم بیوتکنولوژی می باشد. یکی از این آنزیمهای مهم آنزیم کوتیناز میباشد که یک آنزیم هیدرولازی و ترشحی بوده و کوتین را تجزیه میکند. انزیم کوتیناز متعلق به خانواده سرین هیدرولازها بوده و به دلیل خواص ساختاری و عملکردی در حذف آلودگی های زیست محیطی اهمیت بسیار زیادی دارد. آنزیم کوتیناز اسیدهای چرب کوتین را با هیدرولیز باندهای استری آزاد میکنند. استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسم ها مستلزم ترشح آنزیم های هیدرولازی است. اگرچه هنوز مشخص نیست که چگونه یک پلیمر می تواند وارد سلول شده و باعث تولید آنزیم های هیدرولازی شود، اما یک احتمال در این زمینه این است که میکروارگانیسمها یک سطح پایهای از چندین آنزیم هیدرولازی ترشح میکنند و سپس با عملکرد این آنزیمها بر روی مواد پلیمری، این مواد هیدرولیز شده و محصولات هیدرولیز شده وارد سلول شده و سنتز آنزیمها را القا می کنند .
کوتیناز یک آنزیم چند منظوره است و چندین مشخصه جالب دارد که می تواند در فرایندهای صنعتی استفاده شود. از مهمترین شاخصههای این آنزیم توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلی استرهای کوچک میباشد.
کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسید چرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافتهاند. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 بوده و شامل یک تا سه گروه هیدروکسیل میباشند. کوتینازها میتوانند به عنوان یک رابط بین استرها و لیپیدها در نظر گرفت، این آنزیم استرهای محلول را هیدرولیز میکند و تریگلیسریدها را امولوسیون میکند بنابراین کوتیناز به عنوان یک آنزیم لیپولیتیک در مواد شوینده لباس و ظرف برای چربیزدایی به کار رفته است. از این آنزیم به عنوان یک biocatalyst و یک bioprocesses صنعتی در بیوتکنولوژی استفاده شده است. یکی دیگر از کاربردهای جالب کوتیناز تجزیه پلاستیکها است. به عنوان نمونه، تجزیه پلی کاپرولاکتون که یک پلی استر سنتزی میباشد به محصولات محلول در آب با استفاده از آنزیم کوتیناز انجام گرفته است. دیگر کاربردهای کوتیناز عبارتند از شرکت در واکنش های سنتزی و هیدرولیتیک میباشد که از جمله آنها میتوان به هیدرولیز چربی شیر در صنایع لبنی، استفاده در صنایع oleochemistry و سنتز تریگلیسریدهای ساختاری اشاره نمود. یکی از خصوصیات ویژه آنزیم کوتیناز، فعالیت آن با گسترهای از سوبستراهای مختلف میباشد که باعث شده این آنزیم در صنعت و تکنولوژی مورد استفاده قرار گیرد. این آنزیم همچنین باعث افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی کشاورزی شده است. با توجه به طیف وسیع عملکردی آنزیم در برابر سوبستراهای متنوع و قابلیت تجزیه و سنتز انواع ترکیبات پلی استری، این آنزیم می تواند در رفع آلودگیهای زیست محیطی نقش مهمی ایفا کند و این ویژگی باعث شده است که این آنزیم در صنعت و بیوتکنولوژی مورد توجه قرار گیرد.
یکی از مشکلات زیست محیطی در جوامع امروزی تجزیهی زبالهها در محیط زیست است. کوتیناز به عنوان یک آنزیم سبز میتواند توانایی از بین بردن زبالههای پلیاستری را دارا باشد و میتوان از آن در سنتز پلیاسترهای قابل تجزیه در طبیعت استفاده کرد.
کوتیناز ها و لیپازها متعلق به گروه استراز ها هستند که قادر به تسریع هیدرولیز باندهای استری هستند. نسبت اجزای سازنده آمینواسیدی کوتیناز باکتریایی به طور کاملا مشخص از کوتیناز قارچی و گیاهی متفاوت است. کوتیناز یک کاتالیست موثر در محیطهای آبی یا ارگانیک است. این مجموعه ویژگیها باعث شده است که این آنزیم در صنعت و تکنولوژی مورد توجه قرار گیرد. لذا شناسایی سویههای مختلف بومی تولید کننده این آنزیم از اهمیت خاصی برخوردار است.
با توجه به طیف وسیع عملکردی آنزیم در برابر سوبستراهای متنوع و قابلیت تجزیه و سنتز انواع ترکیبات پلی استری، این آنزیم می تواند در صنعت, علومکشاورزی و پزشکی نقش مهمی ایفا کند و این ویژگیها باعث شده است که این مطالعه ویژگیهای این آنزیم و شناخت گونههای جدید باکتریایی و قارچی این آنزیم از جایگاه ویژهای برخوردار باشد.
فرضیات واهداف تحقیق
باکتریهایی که قادر به ایجاد بیماری در سطح گیاهان میباشند قادر به تجزیه کوتین این گیاهان اند. میزان بالای کوتین در گیاهان و بخصوص میوهها، مقاومت بیشتری را در برابر آفات میکروبی فراهم میکند و شناخت این امر به شناسایی حساسیت میوهها در برابر آفات کمک میکند. بدین منظور از پوست میوههای مختلف کوتین استخراج شد و میزان آن در چند میوه مقایسه شد.
هدف از این پژوهش در مرحله اول مطالعه و مقایسه میزان کوتین در میوههای مختلف و در مرحله بعد جداسازی و شناسایی یک گونه باکتریایی تولید کننده آنزیم کوتیناز میباشد که ممکن است آنزیم کوتیناز آن ویژگی های مطلوبتری نسبت به سایر آنزیمهای کوتیناز شناخته شده داشته باشد. گونه ها انتخاب شده در محیط کشت های حاوی کوتین کشت داده می شوند و سپس فعالیت آنزیمی سویههای تولیدکننده کوتیناز با استفاده از پارا نیترو فنیل بوتیرات سنجیده میشود و سپس توالی ناحیه16S rDNA برای تعیین توالی فرستاده میشوند.
فصل دوم
مروری بر کلیات و تحقیقات پیشین
اصولا برای‌ اینکه‌ یک‌ آفت گیاهی‌ بتواند به‌ داخل‌ گیاه‌ رخنه‌ کند بایستی‌ از سدهای‌ دفاعی‌ مختلفی‌ عبور کند. این‌ سدهای ‌دفاعی‌ از مواد مختلفی‌ از قبیل‌ موم‌های‌ کوتیکولی‌، کوتین‌، مواد پکتینی‌، سلولز، همی‌ سلولز، لیگنین‌ و… تشکیل‌ می‌شوند. گروه‌های‌ اصلی‌ مواد شیمیایی‌ مترشحه‌ بوسیله‌ آفات، آنزیمها، مواد سمی‌، مواد کنترل‌ کننده رشد، پلی‌ساکاریدها و آنتی‌ بیوتیک ها هستند. در بعضی‌ بیماریها مانند پوسیدگی‌های‌ آبکی‌، آنزیم ها به‌ مراتب‌ اهمیت‌ بیشتری‌ دارند. احتمالا تمام‌ دستجات‌ آفات‌گیاهی‌ به‌ استثنای‌ ویروس ها و ویروئیدها قادر به‌ ترشح‌ آنزیم ها، مواد کنترل‌ کننده‌ رشد، پلی‌ ساکاریدها و احتمالا مواد سمی‌ هستند. آنزیمهای‌ آفات‌ گیاهی‌ اجزای‌ ساختمانی‌ سلولهای‌ میزبان‌ را متلاشی‌ کرده، مواد غذایی‌ داخل‌ سلول ها را تجزیه‌ و یا مستقیما بر روی‌ پروتوپلاسم‌ تأثیر گذاشته‌ و در نفوذ پذیری‌ و عمل‌ غشاها ایجاد اختلال‌ می‌کنند.
کوتین
کوتین تقریبا تمام بوم سازگانها دارای تنوع گسترده ای از باکتریها، ویروسها، قارچها، نماتودها، کرم ها، حشرات، پستانداران و سایر جانوران علفخوار هستند. گیاهان به خاطر بافت خود قادر نیستند به سادگی از این گیاهخواران و عوامل بیماریزا دوری کنند بلکه باید از راههای دیگری از خویش حفاظت نمایند. یکی از این راهها ایجاد لایه کوتین در سطح گیاه است. کوتین دربرابر نفوذ باکتریها و قارچها سدهایی را ایجاد میکند [5].
همهی بخشهای گیاه که در معرض هوا هستند با لایه ای از مواد چرب پوشیده شدهاند که موجب کاهش اتلاف آب شده و در ممانعت از ورود قارچها و باکتریهای بیماریزا به گیاه کمک میکند. اجزاء اصلی این پوششها کوتین، سوبرین و مومها هستند [6]. کوتین روی اکثر بخشهای هوایی و سوبرین روی بخشهای زیرزمینی، ساقههای چوبی و زخمهای التیام یافته وجود دارد. مومها با هر دو ماده سوبرین و کوتین همراه هستند [5].
مومها ماکرومولکول نیستند اما مخلوط پیچیدهای از آسیل لیپیدهای بلند زنجیر هستند که خاصیت آبگریزی شدیدی دارند. عمدهترین اجزاء مومها آلکانها و الکلهای زنجیرهای بدون انشعاب 25 تا 35 کربنی هستند (شکل2-1). زنجیرههای بلند آلدئیدی، کتونی، استری و اسیدهای چرب آزاد نیز در آن یافت میشوند. موم پوستک به وسیلهی یاختههای روپوستی سنتز میگردد. مومها با عبور از منافذ دیواره اسکلتی به وسیله سازوکارهای نامعلومی یاختههای روپوستی را به صورت ریز قطرههایی ترک مینمایند. پوشش فوقانی موم پوستک اغلب به صورت الگوی پیچیدهای از میلهها، لولهها، یا صفحات متبلور دیده میشوند.
کوتین، سوبرین و مومهای همراه آنها سدی را بین گیاه و محیط آن تشکیل میدهند که وظیفه آن حفظ آب در درون و حفاظت گیاه در برابر عوامل بیماریزا در بیرون است. پوستک در کاهش تلفات آب از اندامهای هوایی گیاه بسیار موثر است اما به طور کامل مانع از تعرق نمیگردد زیرا حتی با بسته شدن روزنهها مقداری آب از دست میرود. ضخامت پوستک با شرایط محیطی تغییر میکند. گونههای گیاهی مناطق خشک نسبت به زیستگاههای مرطوب دارای پوستک ضخیمتری هستند، البته گیاهان زیستگاههای مرطوب وقتی در شرایط خشک رشد میکنند غالبا ضخامت پوستک خود را افزایش میدهند.
پوستک و بافتهای سوبرینی شده هر دو در ممانعت از ورود قارچها و باکتریها مهم هستند.گرچه آنها در مقاومت به عوامل بیماریزا اهمیت زیادی ندارند. بسیاری از قارچها با روشهای مکانیکی و مستقیما از سطح گیاه نفوذ میکنند. قارچهای دیگر کوتیناز تولید نمیکنند، آنزیمی که کوتین را هیدرولیز و بنابراین ورود به گیاه را تسهیل میکند.
پوشش بیرونی از موجودات زنده شامل پلیمری ضد آب است از چربی های غیر قطبی که در مجموع واکس نامیده می شود. کیتین به عنوان جزء ساختاری در حیوانات عمل می کند در حالی که کوتین به عنوان یک جزء ساختاری از پوشش بیرونی (کوتیکول) بیشتر گیاهان عمل می کند. کوتیکول یک مانع در برابر خشکی است.
مطالعات در مورد کوتیکول گیاهان از قرن نوزدهم آغازشده است. اصطلاح کوتین از کوتوس گرفته شده است، این اصطلاح برای توصیف ماده ای که بخشی از اپیدرم برگ را تشکیل داده است و در برابر اسیدهای قوی مقاوم بود استفاده شده است.