اندازه گیری و استراتژی ها

دانلود پایان نامه

سنتز استر از بوتیریک اسید و 2- بوتانول توسط کوتیناز محصور شده در کپسول هایی در حد میکرو در سورفاکتانت غیریونی فسفاتیدیل کولین انجام شد [71]. فعالیت انزیمی برای سنتز بوتیل بوتیرات با افزایش غلظت سوبسترا بر اساس کینتیک Michaelis–Menten افزایش یافته است. با این حال 2- بوتانول و اسیدبوتیریک ، به ترتیب غلظت بالاتر از 500mM و 200mM ، مهار کوتیناز مشاهده شد. ثابت ظاهری Michaelis برای 2- بوتانول و اسیدبوتریک به ترتیب 2/47وmM 8/38 بود. استریفیکاسیون از اسیدلوریک وپنتانول با کوتیناز محصور شده در میسل معکوس AOT انجام شده است [75]. اثر مقدار اب روی فعالیت کوتیناز حداکثر در 0 9 ω نشان داده شده است.
ترانس استریفیکاسیون
واکنش ترانس استریفیکاسیون بوتیل استات با هگزانول در محیط های آلی در چندین سیستم سنجیده شده است [1]. اثرات شرایط واکنش روی فعالیت های تبادل استری از کوتیناز محصور شده در میکروکپسولهای میسل معکوس AOT با استفاده از روش های طراحی فاکتریول مورد بررسی قرار گرفت [76].
فعالیت های بالای کوتیناز در 490mM هگزانول و برای درجه حرارت 40 تا 50 درجه سانتیگراد نمایش داده شده است. AOT باید در یک غلظت پایین تر به دلیل اثر سمی آن بر روی کوتیناز استفاده شود. با وجود این کوتیناز در میسل معکوس AOT فعالیت بالاتری را نسبت به میسل معکوس CTAB نشان داده است [70] (جدول2-5). مقدار pH بین 7 و 8 و مولاریته بافر 200mM برای واکنش تبادل استری موثر است. مطالعات کینتیکی این واکنش انجام شده و پارامترهای کینتیکی تعیین شد [1]{Carvalho, 1998 #104}.
واکنش ترانس استریفیکاسیون با جذب کوتیناز روی زئولیت و دیگر بسترهای رایج (پلی امید، سلیس و الومینا) مورد بررسی قرار گرفته است [68]. فعالیت ترانس استریفیکاسیون کوتیناز به عنوان تابعی از فعالیت های اب اندازه گیری شده است. اثرات ترکیب بندی زئولیت و اسیدیته مورد مطالعه قرار گرفت. بیشتر نتایج نشان دهنده این است که بهترین بسترها دارای اسیدیته پایین و سیلیسیم پایین (نسبت الومینیم که مربوط به ترکیب زئولیتNay ) است.
الکل کافت از متیل پروپیونات با پروپانل در یک سیستم جامد/گاز مورد مطالعه قرار گرفت، میزانaw از 2/0 به 6/0ز تغییر یافت. در کوتیناز رفتار کینتیکی غیرعادی وجود دارد. ارتباط سیگموئیدی مشاهده شده بین نرخ تبادل استری و فعالیت متیل پروپیونات نوعی از فعال شدن همکاری انزیم را توسط یکی از سوبستراها نشان می دهد. بهترین نتایج در aw 6/0 بدست امد.
تفکیک انانتیومری مخلوط راسمیک 1- فنیل اتانول به وسیله کوتیناز جذب شده روی زئولیت NaY درSC CO2 و اتیلن انجام شد [67]. فعالیت کاتالیزوری انزیم به شدت به فعالیت اب وابسته بود، با حداکثرaw 5/0و در اتیلن فوق بحرانی بالاتر از SC CO2 بود، با این حال فشار بالاتر از 300 بار تاثیری نداشت. انزیم نسبت به R– ایزومر از 1-فنیل اتانول بسیار انتخابی بود و با یک انانتیومر اضافی به 100 درصد می رسد. این یافته ها با مطالعات enantioselectivity قبلی مطابق است که در ان کوتیناز یک نسبت فعالیت R/S تا 30 را نشان می دهد [55]. یک مدل کامپیوتری از ساختارهای حالت انتقالی توسط دو انانتیومر تشکیل شده که توضیح ارجحیت کوتیناز برای اناتیومرR را شرح داده است [67].
پایداری کوتیناز
پایداری حرارتی و عملکردی کوتیناز در اماده سازی انزیم در شرایط واکنش مختلف مورد بررسی قرار گرفته است [11, 73, 75, 77] (جدول 2-4). در بسیاری از مطالعات به بررسی میسل معکوس در کوتیناز میکروکپسوله شده، به ویژه در میسل معکوسAOT به دلیل فعالیت های بالای بدست امده پرداخته اند. اولین گزارش روی پایداری کوتیناز محصور شده در میکروکپسول های میسل معکوس AOT نشان داد که نیمه عمر انزیم بسیار کوتاه است. در ω0 10 و pH 6/9 در 25 درجه سانتیگراد نیمه عمر 15/0 ساعت تعیین شد و تنها 20 درصد از فعالیت های اولیه در ω0 20 باقی ماندند[78, 79]. این نتایج در مطالعات انجام شده توسط Papadimitriou و همکاران بر تاثیر ω0 روی پایداری کوتیناز در میسل معکوس ایزواکتان/AOT، 1/0M تایید شد (جدول2-5). غیر فعال کردن سریع کوتیناز در AOT معکوس شده ی میسلی با توجه به روند برگشت پذیر دناتوراسیون رخ می دهد. دناتوراسیون احتمالا توسط تعامل بین انزیم و رابط سورفاکتانت از میسل معکوس ایجاد می شود، زیرا در محلول ابی، انزیم ازاد تا درجه حرارت 85 درجه را تایید می کند و در غیاب اب (پودر لیوفیلیزه) درجه حرارت بهینه برای ترانس استریفیکاسیون 80 درجه سانتیگراد می باشد [66]. هنگامی که اندازه ی حفره ابی میسلی معکوس تو خالی کوچکتر از کوتیناز باشد(به عنوان مثال ω0 5) یک مدل سه حالته، دناتوراسیون و غیر فعال کردن با یک حالت کنفورماسیونی حدواسط موجود در مسیر کوتیناز طبیعی به دناتوره را توضیح می دهد. در ω0 20 نشان داده شده که اندازه میسل خالی بزرگتر از کوتیناز و داده ها توسط یک مدل دو حالته که در انها تنها کوتیناز طبیعی و دناتوره حضور داشتند توصیف شد [79]. استراتژی های تثبیت کننده برای این سیستم انزیمی ایجاد شده است. ویژگی مهمی که تاثیر مثبت بر حفظ فعالیت کوتیناز می گذارد استفاده از الکل،یعنی هگزانول است، که از غیر فعال کردن کوتیناز جلوگیری می کند [73]. نیمه عمر کوتیناز در میسل معکوس AOT حاوی 250Mm هگزانول در pH 10 و در ℃ 15 و ω0 4 در حدود 60 روز نشان داده شده است [73]. روشی که در ان کوتیناز محصور شده در میکروکپسول های هگزانول حفاظت می کند هنوز هم مورد بحث و بررسی است.
برای بهینه سازی فعالیت و پایداری کوتیناز در میسل معکوس AOT از طرح فاکتریول استفاده شد [1, 11]. کوتیناز در 40 درجه سانتیگراد انکوبه شده و یک سطح بالای فعالیت (90درصد) بعد از سه روز هنگامی که مقدار ω0 7/2 بود حفظ شده است [11]. میزان ω0 در محدوده ی 5 تا 8 فعالیت اختصاصی بهینه دارد. تغییرات شدت فلورسانس وابسته به زمان تایید کرده است که کاهش در مقدار اب، پایداری کوتیناز در میسل معکوسAOT را بیشتر می کند [11].
هگزانول با غلظت 500 تا 600mM نشان داده شده که برای جلوگیری از غیرفعال شدن کوتیناز ضروری است. عملکرد کوتیناز به شدت تحت تاثیر هگزانول در میسل معکوس AOT است، به طوریکه برای ان نقش های متعددی به عنوان سوبسترا از قبیل یک کوسورفاکتانت و یک تثبیت کننده ایفا میکند. اثر هگزانول در مقاومت حرارتی کوتیناز در 30 درجه سانتیگراد و pH 8 و ω0 2/7 در حضور 150mM AOT در ایزواکتان مورد بررسی قرار گرفته است. در عدم حضور هگزانول نیمه عمر 7/2 ساعت بدست امده در صورتیکه در حضور 1000mM هگزانول نیمه عمر 159 روز تخمین زده شده است [1]. این به وضوح نقش هگزانول را به عنوان یک تثبیت کننده در سیستم نشان می دهد.
غیر فعال کردن کوتیناز به وسیله ی سورفاکتانت های انیونی در مطالعات SDS تایید شد. آمفی پاتهای انیونی مونومری موجب تشکیل سریع یک واسطه غیر فعال برگشت پذیر به علت باز شدن پیچش بخشی از کوتیناز می شود.
جدول ‏24 پایداری کوتیناز [11]
فرایندهای در حال توسعه: بیوراکتور کوتیناز
تعداد اندکی از کارهای انجام شده در مورد توسعه فرایند و بیوراکتورهای کوتینازی منتشر شده است[11, 66]. بستر بیوراکتور گاز جامد توسعه داده شد تا واکنش ترانس استریفیکاسیون، انجام تبادل استری متیل پروپیونات و پروپانول با استفاده از کوتیناز لیوفیلیزه شده به عنوان فاز جامد انجام بگیرد. مطالعات راکتور نسبتا محدود بود به دلیل اینکه هیچ داده ای که اثر سرعت جریان گاز را روی تبدیل نشان دهد ارائه نشده است. از خصوصیات اصلی این مطالعه واکنش مداوم برای 150 ساعت در 65 درجه سانتیگراد بدون از دست دادن فعالیت است. عملکرد BSTR ( Batch stirred-tank reactor) برای هیدرولیز تریپسین با کوتیناز جذب شده بر روی زئولیت NaY آنالیز شده است. مطالعات کینتیکی در این نوع راکتور و همچنین اثرات انتقال جرم روی فعالیت آنزیمی انجام شده است. بیشترین مطالعات در یک راکتور غشایی میسلی معکوس (MBR) شامل کوتیناز های میکروکپسوله شده برای ترانس استریفیکاسیون از بوتیل استات با هگزانول انجام شده است. کوتیناز پس از بهینه سازی مطالعات پایداری کوتیناز با ω° و هگزانول یک مولار در میسل های معکوس AOT میکروکپسوله شده است.
نتایج آزمایشات مختلف به وضوح نشان می دهد که به کمک استفاده از محیط آلی و مهندسی راکتور برای غلبه بر غیرفعال شدن کوتیناز توسط سورفاکتانت آنیونی که از کاربردهای بالقوه کوتیناز میباشد میتوان استفاده کرد. در این شرایط یک پیشرفت قابل توجه در بهبود کوتیناز تثبیت شده دیده شده در حالی که بازده تبدیل بالا نیز بدست امد. سودمندی بالا و ثبات بهره برداری بدست امده از این سیستم راکتور میسلی معکوس امیدی برای فرایندهای بیوترانسفورماسیون است[11].
مکانیسم عمل کوتیناز
مکانیسم عمل به این صورت است که ابتدا سوبسترا از طریق کربن متصل به گروه کربونیل خود به جایگاه فعال متصل میشود، سپس سرین سه گانه کاتالیتیک به کربن کربونیل حملهی نوکلئوفیلی میکند و هیستیدین با جذب پروتون گامای سرین سبب فعال شدن اکسیژن گاما و متعاقب آن آماده کردن آن برای حمله نوکلئوفیلی میشود. نتیجهی حملهی نوکلئوفیلی، تشکیل پیوند کوولان بین اکسیژن گامای سرین و کربن سوبسترا و ایجاد حدواسط تتراهدرال است. بار منفی که همزمان با تشکیل حدواسط تتراهدرال به اکسیژن کربونیل منتقل شده با تشکیل پیوند هیدروژنی بین دو گروه آمید سرین و گلوتامین به عنوان دهنده و اکسیژن کربونیل به عنوان گیرنده پایدار میگردد. به این بخش خاص آنزیم به علت پایدارسازی بار منفی اکسیژن، حفره اکسی آنیون گفته میشود.
مرحله نهایی به حمله نوکلئوفیلی آب به پیوند استری بین سرین سه گانه کاتالیتیک و سوبسترا انجام میشود. در این مرحله سوبسترا از دهانه فعال آنزیم جدا و خارج میشود. با خالی شدن دهانه فعال آنزیم، امکان اتصال سوبستراهای دیگر فراهم میشود.
آمینواسید سرین نقش کلیدی در کاتالیز دارد. بقیه ی آمینواسیدها با پایدارسازی بار به این فرآیند کمک می کنند. آسپارتات در فاصله نسبتا دوری از سوبسترا واقع شده است و در جایگیری مناسب هیستیدین نسبت به سوبسترا نقش دارد، همچنین با افزایش ثابت اسیدی هیستیدین باعث ایجاد خاصیت بازی میشود. مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز در شکل 2-10 قابل مشاهده است.
شکل‏29 مکانیسم عمل کوتیناز [14]
یکی از خصوصیات ویژه آنزیم کوتیناز، فعالیت آن با گسترهای از سوبستراهای مختلف بوده و میزان km وmax v این آنزیم در برابر سوبستراهای مختلف مقایسه شده است. جدول 2-5 میزان فعالیت آنزیم کوتیناز را در برابر سوبستراهای مختلف نشان میدهد.
جدول ‏25 فعالیت آنزیم کوتیناز در برابر سوبستراهای مختلف [12]
همچنین میزان پایداری TfCa در شرایط دمایی و pH های مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. این مطالعه نشان میدهد که در شرایط pH=8 و دمایی برابر 50 درجه سانتیگراد آنزیم کوتیناز دارای بالاترین فعالیت در مدت زمان 100 ساعت است. در شکل 2-11 زیر توانایی و میزان مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما و PH قابل مشاهده است