اندازه گیری و امکان تولید

دانلود پایان نامه

Biphasic medium
Organic media
Gas/solid system
Lyophilized preparation
Solution
Suspensin
Solid form
کوتیناز لیوفیلیزه برای تعیین مکانیسم واکنش stereoselectivity استفاده شده است، کوتیناز لیوفیلیزه همچنین به یک سیستم دوفازی آبی- ترئولین اضافه شد که این تریگلیسیرید را به اسید اولئیک و گلیسرول هیدرولیز میکند [59]. کوتیناز بر روی بسترهای جامد بصورت جذبی یا اتصال کوولانت تثبیت شده و در هیدرولیزهای مختلف[60-62]، استریفیکاسیون [63] و واکنش تبادل استری [64-66] استفاده میشود. بیشتر مطالعات جذبی کوتیناز بر روی Accurel EP 100، یک بستر macroporous polypropylene انجام شده است [63]. این بستری مناسب برای تثبیت کوتیناز است که منجر به اماده سازی انزیم فعال و با ثبات میشود.
اتصال کوولانسی کوتیناز بر روی تکیهگاه سلیکا و مشتقات سلیسی مورد بررسی قرارگرفتهاست. هرچند نتایج نشان میدهد بازده جفتشدگی (6 تا 26%) و پایداری دمایی آن بسیار پایین است. این نتایج بیان میکند که جفتشدگی کوولانت به نظر نمیرسد که یک روش کافی برای تثبیت کوتیناز باشد.
از زئولیتها به طور موفقیت آمیزی به عنوان بستر مناسب برای جذب کوتیناز در یک مجموعهای از آزمایشات استفاده شده است [67].
زئولیتها سلیکولومینتهای بلوری هستند که دارای ساختار بسیار دقیق میکروپوروس بوده که برخی از ویژگی های عمومی شناخته شده مسئول در کاربردهای گسترده انها در تجزیه، جذب و تبادل یونی را نشان میدهد [68]. این خصوصیات با امکان تولید و تنظیم اسید-باز و خصوصیت ابگریز_ابدوست و تمایل زیاد به جذب انتخابی مرتبط است. بنابراین سطح خارجی کریستالی زئولیت ،ویژگیهای جالبی برای جذب آنزیم ارائه میدهد که می تواند به عنوان یک رابط فاز ابی در داخل زئولیت و محیط آلی حاوی سوبستراها استفاده میشود. کوتیناز با موفقیت بر روی زئولیت های مختلف با بازده بالای کوپلینگ (60 تا 80%) و فعالیت خاص ، برای مثال روی زئولیت NAY (9 U/mg enzyme) تثبیت شده است. در کوتیناز تثبیت شده پایداری دمایی بالا نشان داده شده(45 روز 30 درجه سانتیگراد بدون از دست دادن فعالیت) که بسیار بالاتر از پایداری دمایی گزارش شده بر روی بسترهای دیگر است [60].
کوتیناز به دام افتاده در کپسولهایی از ماتریکس ژل یک روش نامناسب برای تثبیت کوتیناز میباشد. به دلیل ویژگی آب دوست بسیاربالای آلژینات، تفکیک و پخش هر دو اثر باز دارنده روی عمل کاتالیزوری کوتیناز دارد که این عمل برای دیگر لیپازها در سوبستراهای چربی دوست رخ میهد [60].
یکی دیگر از روشهایی که از کوتیناز استفاده میکند تثبیت کوتیناز در میکروکپسولهایی از میسل معکوس ار سورفاکتانت در محیطهای الی است که با موفقیت برای هیدرولیز [69]، استریفیکاسیون [70, 71] و تبادل استری [72] استفاده میشود. میسل معکوس یک سیستم مناسب برای توسعه biocatalysis در محیطهای آلی است. محلول کردن آنزیمها در حفرهی آب از میسل معکوس موجب حفظ فعالیت کاتالیستی آنزیم در برابر اثر منفی حلال بر ساختار آن می گردد. علاوه براین encapsulation در میسل معکوس یک ناحیه بین سطحی فراهم میکند و امکان ایجاد حلالیت سوبستراهای آبگریز و آبدوست را فراهم کرده و اغلب فعالیت انزیم را افزایش میدهد. جدایی محصولات و بهبود عمل انزیم امکانپذیر شده و زمینه تحقیق در خصوص استفاده از میسل ایجاد میشود. یکی از پارامترهای مهم برای فعالیت بهینه آنزیم در میسل معکوس نسبت مولی اب به سورفاکتانت است که اغلب ω0 گفته میشود. حداکثر تمایز در فعالیت آنزیمی معمولا زمانی که 0ω ارزش دارد یافت میشود. اندازه میسل معکوس به این پارامتر بستگی دارد. وقتی که ارزش 0ω کم می شود میسل ها ممکن است بیش از اندازه برای جا دادن مولکولهای آنزیم کوچک شوند، در مقادیر بالا مقدار زیادی آب موجود است که ممکن است با واکنش آنزیمی تداخل نماید.
انتخاب شرایط قابل استفاده نباید منحصرا بر اساس این معیارها باشد، چون بهترین معیار برای تثبیت ممکن است با انهایی که برای فعالیت بیشتر مورد بحث قرار میگیرد منطبق نباشد. در محیط آلی ممکن است تغییر تعادل واکنش به سمت سنتز باشد. به وسیلهی کنترل صحیح مقدارآب یک واکنش هیدرولیزی از استر میتواند منجر به تولید یک الکل و اسید شود که میتواند استریفیکاسیون معکوس را انجام دهد. همچنین واکنش تبادل استری و اینتراستریفیکاسیون میتواند در کم ابی انجام گیرد.
کنترل شرایط واکنش و نیز تبدیل سوبسترا با استفاده از روش های دقیقتر بهبود یافته است.یک مثال خوب از روش nuclear magnetic resonance) NMR) برای نظارت انلاین روی واکنش کاتالیز لیپاز در حلالهای الی بدون نیاز به نمونه در محیط واکنش توسعه یافته است.
عملکرد کوتیناز در واکنشهای هیدرولیزی و سنتزی
هیدرولیز
هیدرولیز تریگلیسیریدها و انالوگها به وسیلهی کوتیناز در چندین سیستم واکنش برای مثال در میسل معکوسAOT و سیستم های دو فازی مورد مطالعه قرار گرفته است. در سیستم دو فازی تبدیل triolein با استفاده از یک سیستم تک لایه دنبال شد [58]. آنالیز کینتیک هیدرولیز تریگلیسریدهای مختلف، تریکاپریلین، تریلورین و تریمریستین tricaprylin, trilaurin and) trimyristin) نیز انجام گرفته است [69]. کوتیناز فعالیت بیشتر و اختصاصی را برای زنجیره کوتاهتری گلیسیرید مورد مطالعه نشان میدهد. این نتایج مطابق با دیگر یافتهها دربارهی انتخابی بودن و اختصاصیت کوتیناز است.
هیدرولیز تری کاپریلین به وسیلهی کوتیناز جذب شده بر روی زئولیت NAY ، اتصال کوولانت آن بر روی سلیکای متخلخل و محبوس کردن آن در آلژینات کلسیم نیز مورد مطالعه قرار گرفته است [60]. مقدار pH در حدود 8 برای هر سه کوتیناز تنظیم شد و بیشترین فعالیت اختصاصی با جذب کوتیناز روی زئولیت بدست آمد (جدول2-5).
استریفیکاسیون
سنتز استر اسیدهای چرب به وسیلهی کوتیناز در میسل معکوس از هر دوسورفاکتانت های AOT انیونی [73] و CTAB کاتیونی [70] مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته است. استریفیکاسیون اولئیک اسید با الکل های الیفاتیک به وسیله کوتیناز محصور شده در میکرو کپسولهای میسل معکوس AOT نشان داد که کوتیناز دارای اولویت برای C5 به الکل های C6 است [73]. اثر طول زنجیره اسیدچرب در استریفیکاسیون هگزانول نیز مورد بررسی قرار گرفت و حداکثر فعالیت با بوتریک اسید بدست امد، بعضی واکنش ها نیز با کوتیناز محصور شده در میسل معکوس CTAB انجام شده است[70]. کوتیناز با حداکثر فعالیت استریفیکاسیون از هگزانول با بوتریک اسید نتایج مشابهی می تواند بدست اید. با این حال فعالیت کوتیناز در میسل معکوس AOT بیشتر از میسل معکوسCTAB است.
استریفیکاسیون هگزانول با اسیدبوریک با استفاده از جذب کوتیناز Accurel EP-100 حلالهای امتزاج نشدنی با اب (هگزان و diisopropylether) و حلال های امتزاج پذیر در اب (acetonitrile) به وسیله محققان دیگر مورد بررسی قرار گرفته است. این واکنش به عنوان یک سیستم مدل برای مطالعه اثرات متقابل اب و اثر محلول بر روی کوتیناز ، یعنی حلال پوشی با واکنش کننده ها استفاده شده است. نتایج نشان داده است که بهینه فعالیت اب با افزایش قطبیت حلال کاهش یافته است. حلال پوشی سوبستراها به شدت به وسیله اب در استونیتریل تحت تاثیر قرار می گیرند. ثابت Michaelis برای هگزانول در هگزان در دو مقدار aw (44/0 و 69/0) به ترتیب 170وmM 295 بود. این مقادیر بالا از Km بدست امده برای هگزانول در واکنش های کاتالیز شده در میسل معکوس AOT ،Km=86 mM، که ممکن است از اثرات انتشار بالاتر موجود در انزیم حمایت شده هنگامی که با کوتیناز محصور شده درکپسولهایی در حد میکرو مقایسه می شود ناشی شود [73].
استریفیکاسیون هگزانوئیک اسید با هگزانول نیز انجام می شود [63]. در SCCO2 ، این واکنش هنگامی که با سیستم میسلی معکوس CTAB مقایسه می شود بسیار کند است [70]. سرعت واکنش اولیه در SCCO2 به طورقابل توجهی پایین تر بود، همچنین حالت تعادل در محیط واکنش فوق بحرانی تنها پس از 5 روز بدست آمد.
استریفیکاسیون اسید کاپریلیک با بوتانول همچنین با کوتیناز لیوفیلیزه شده انجام شده است [74]. حدود 80 درصد از استریفیکاسیون می تواند پس از 7 ساعت بدست اید با استفاده از 1H NMR غلظت الکل، استر، هیدروژن هیدروکسیلیک در فاز الی و هیدوژن هیدروکسیلیک در فاز ابی اندازه گیری شد. نتایج 1H NMR نشان داد که اب تولید شده در اغاز واکنش به وسیله کوتیناز حفظ می شود. بعد از انجام واکنش، این آب سنتز شده با تشکیل یک فاز آبی قابل تشخیص می شود.