انعطاف پذیری و عدم اطمینان

دانلود پایان نامه

ساختار کوتیناز
در سالهای اخیر ساختار کریستالی آنزیم کوتیناز از چندین میکروارگانیزم (Rhizomucor miehei , Candida antartica B, Candida rugosaPseudomonas glumae , Chromobacterium viscosum, Rhizopus delemar, Humicola lanuginose , Geotrichum candidum, Pseudomonas cepacia, Penicillium camembertii, and Pseudomonas mendaccino) و لیپاز پستانداران (لوزالمعده انسان) گزارش شده است. همهی لیپازهایی که تا کنون بررسی شده اند به طور گسترده ای از نظر اندازه و توالی اسید امینه متفاوتاند. کوتیناز متعلق به رسته آنزیمی سرین استراز ها است و یک عضو از بالاخانواده الفا/ بتا هیدرولازها است. ساختار این آنزیم شامل بتا شیت مرکزی شامل پنج رشته موازی است که توسط دو یا سه هلیکس در دو طرف صفحه پوشیده شده است. این رشته مشابه رشته b3-b7 از تاخوردگی الفا بتا هیدرولاز و اتصال -1×،+2×، +1×،+1× است (شکل2-6).
شکل ‏26 هیدرولاز آلفا و بتا [37]
لیپاز یک کمپلکس کاتالیتیکی است شبیه به آنهایی که در سرین پروتئازها وجود دارند. مشخصه آنها سه اسیدآمینه سرین،هیستیدین وآسپارژین مشخص میباشد و به وسیله یک موقعیت اتصال اکسی آنیون حالت گذار را از طریق پیوند هیدروژنی با دو گروه اصلی زنجیره آمید پایدار میکند.
بیشترین مطالعات بر روی کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی انجام شده که در E.coli کلون و بیان شده و ساختار آن با دقت Å 6/1 تعیین شده است [38] اخیرا دقت این ساختار تا دقت Å 1 گسترش یافته است [39, 40]. روشهای کریستالوگرافی که معمولا بر روی کریستال های بدست امده توسط روش انتشار بخار (vapor diffusion) انجام میگیرد به وسیله Abergel وهمکاران شرح داده شده است [41].
شکل ‏27 ساختار کوتیناز [11]
کوتیناز یک پروتئین با 197 باقی مانده است که دارای یک دمین فشرده بوده و در اندازه45 × 30× 30A3 است. کوتیناز با وزن مولکولی حدود 22000 دالتون صفحات بتای کشیده بسیار محافظت شده دارد که با چهار سیستئین ثابت تشکیل دو پل سولفیدی می دهند که در تمامیت ایجاد ساختار کلی نقش مهمی بازی می کند. مطالعات بیشتر بر روی ساختار اولیه نشان داده است که اختلال در این پل های دی سولفیدی به شدت ساختار و فعالیت آنزیم را تحت تاثیر قرار میدهد به گونهای که شکاف جایگاه فعال را به هم ریخته و سهگانه کاتالیزی به اندازه کافی به منظور کاتالیز نزدیک هم قرار نمیگیرند [42].
دنباله گلیسین- تیروزین- سرین- گلوتامین- گلیسین که دارای سرین 120 در جایگاه فعال میباشند دارای همولوژی زیادی با توالی حفاظت شده ی گلیسین (تیروزین یا هیستیدین)- سرین-X –گلیسین دارد که معمولا در لیپازها وجود دارد. سه گانه (مجموعه سه تایی) کاتالیزوری سرین 120، آسپارژین 175، هیستیدین 188 (شکل2-9) در دسترس حلال است و به وسیله لوپ 80-87 و لوپ هیدروفوبی 180 -188 احاطه شده است [39]. علاوه بر این جایگاه فعال انعطاف پذیری قابل ملاحظه ای ارائه می دهد که می تواند سازگاری با سوبستراهای مختلف را توضیح دهد [40]. تا به امروز حدود 40 ساختار کریستالوگرافی از کوتیناز و نمونههای جهش یافته آن و نمونههای متصل به ترکیبات مهارکننده تعیین شده است[38, 39, 41, 43, 44].
مشخص شده است که با وجود این که کوتیناز فعالیت لیپولیتیکی دارد از لیپاز های کلاسیک متفاوت اند زیرا آنها فعالیت بین سطحی نشان نمی دهند. این پدیده برای لیپاز برای انجام فعالیت خود لازم است که علت آن وجود یک درب آبگریز در ساختار آنزیم است که جایگاه کاتالیزوری را پوشش میدهد. به نظر میرسد که تغییر کنفورماسیونی درب رابطه نزدیکی با روند فعال سازی بین سطحی دارد که منجر به افزایش زیادی در سطح ابگریز شده و به وسیله اینترکشن با بینسطحی پایدار میشود [44]. همچنین نتیجه حرکت درب در لیپاز تشکیل یک حفره اکسی انیونی میباشد که در طی حمله نوکلئوفیلی به سوبسترا رخ میدهد. این حفره اکسی انیون توسط یک گروه از دهندگان هیدروژن تشکیل میشود که کمک میکند تا اکسیژن کربونیل کاتالیزوری با بار منفی که ناشی از تشکیل کمپلکس حدواسط است پایدار شود[44].
در کوتیناز لوپ های ذکر شده 80-87 و 180-188 دارای اسیدامینه های هیدروفوبیک میباشد (لوسین 81، گلیسین 82 ، الانین 85، لوسین -86، ایزولوسین-183، والین-184) که ممکن است محل اتصال بین سطحی را تشکیل دهد. با وجود پلهای زنجیره جانبی از اسید امینه ها ، لوسین-81 و والین -184 و لوسین -182 و اسپارژین – 84 ، سرین کاتالیزوری کوتیناز در زیر لوپ های سطحی مدفون نشده اما برای حلال و سوبسترا در دسترس است [38]. فقدان یک فلپ سرین جایگاه فعال را همانند سایر لیپازها میپوشاند و احتمالا توضیح میدهد که چرا کوتیناز در حضور بینسطحی فعال نیست. به نظر میرسد که اتصال کوتیناز به بینسطحی به باز ارایی زنجیره اصلی همانند لیپازها نیاز ندارد، اما تنها جهت گیری مجدد چند زنجیره جانبی چربی دوست، به عنوان مثال لوسین-81 و لوسین-182 که نقش یک مینی فلپ را بازی میکنند کافی است. حضور درب برای اتصال سوبسترا مهم است و همچنین میتواند به ویژگی سوبسترایی مربوط شود. از ویژگیهای مهم دیگر در ساختار کوتیناز حفره اکسی آنیون تشکیل شده در کوتیناز است که به جای اینکه به وسیلهی اتصال لیگاند القا شود به نظر میرسد که به وسیلهی زنجیرهی جانبی سرین 42 در کوتیناز تثبیت میشود.
زمانی که فلورسانس برای مشاهده مستقیم تشکیل تجمعات آنزیم- چربی مورد استفاده قرار گرفت به این نتیجه رسیدند که کوتیناز رفتاری مانند لیپاز به جای استراز دارد. حتی در زیر غلظت میسلار بحرانی از سوبستراهای میسلار، کمپلکس کینتیکی کوتیناز ممکن است تشکیل شود. این همچنین توضیح میدهد که کوتیناز یک سرین در جایگاه فعال در معرض حلال دارد که میتواند رفتاری مشابه لیپاز فعال شده بین سطحی داشته باشد [45]. اخیرا عدم فعال سازی بین سطحی در کوتیناز توسط روش رزونانس مغناطیسی هستهای (NMR) تایید شده است [46].
یکی دیگر از ویژگیهای مهم در مورد ساختار کوتیناز حفره اکسی انیون است که زنجیره اصلی نیتروژن از گلوتامین-121 و سرین-42 در کوتیناز تشکیل شده است بدون اینکه با اتصال لیگاند تشکیل آن القا شود [44]. به نظر میرسد حفره اکسی آنیون کوتیناز به وسیله سرین-42(Ser-42 Oγ) پایدار میشود به طوریکه جهش این سرین الانین منجر به کاهش 450 برابری فعالیت میشود هر چند که در ساختار سه بعدی آنزیم به طور قابل توجهی تغییر ایجاد نشده است [47]. این نتیجه تایید میکند که معمولا در سرین پروتئازها حفره اکسی انیون در یک فرم competent از انزیمهای بدون سوبسترا وجود دارد [48]. با این وجود، مطالعات ساختاری NMR نشان داده است که رزیدوهای سرین-42 و گلوتامین-121 در مقایسه با مشاهدات انجام شده در ساختار کریستالی کاملا متحرک میباشند [49]. لذا این مطالعات یک سطحی از عدم اطمینان به فرضیه تشکیل حفره اکسی انیون ایجاد میکند.
به نظر میرسد ساختار دوم کوتیناز در محلول با ساختار آن در کریستال پروتئین یکسان است [46]. مطالعه ساختار کوتیناز رشد کرده است و نسبت تکنیکهای مختلف که جوانب قابل توجهی از آنزیم را شرح میدهند در جدول 2-1 خلاصه شده است.
القا انتخابی کروموفورهای آروماتیک، تریپتوفان (296 نانومتر)، تیروزین (280 نانومتر) آنزیم کوتیناز به منظور مطالعات فلورسانس استفاده شده است تا فهم ما را دربارهی جایگاه رزیدوهای اروماتیک افزایش دهند. Weisenborn و همکاران در سال 1996برای اولین بار بر روی فلورسانس تریپتوفان به شدت ضعیف شده در محلول ابی کوتیناز تحقیق کردند. تغییرات کنفورماسیونی در محیطهای مختلف میکرو از قبیل محلولهای آبی و در حضور SDS میسل معکوس آنیونی و سورفاکتانتهای کاتیونی دنبال شده است. فرایندهای بازشدگی موجب در دسترس قرار گرفتن تریپتوفانی که در یک منطقه نا قطبی مدفون شده است میگردد که با تغییر حداکثر شدت فلورسانس انتشار طول موج آن ازطول موج 303 نانومتر (محلول ابی اصلی)به طول موج 335 نانومتر (کوتیناز دناتوره شده) نشان داده شده میشود.
جدول ‏21 مطالعه ساختار- عملکرد کوتیناز به کمک تکنیکهای مختلف [11]
References
Field of application
Classification
Structure determination
Abergel et al., 1990; Jelsch et al., 1998;
Longhi et al., 1996, 1997a,b;
Martinez et al., 1992, 1993, 1994;
Nicolas et al., 1996; Petersen et al., 1998
Resolution of three-dimensional structure; elucidatio