باستان شناسی و تولید انبوه

دانلود پایان نامه

– توزین اتیدیوم بروماید حتماً باید در مکان بسته بدون جریان شدید هوا با استفاده از ماسک و دستکش دو لایه انجام شود.
– زباله های آلوده به اتیدیوم بروماید، بافرها و ژل های آلوده به طور مجزا دفع شود.
– دستکش و سایر لوازم آلوده به اتیدیوم بروماید را هرگز از اتاق UV خارج نکنید.
– در صورتی که لباس یا پوست به اتیدیوم بروماید آغشته شود، باید فوراً لباس آلوده را از تن خارج کرد و پوست را با مقدار فراوان آب و صابون شستشو داد.
– در صورت آلوده شدن چشم باید آن را با آب فراوان به مدت حداقل 15 دقیقه شستشو داد.
– در صورت بروز هر حادثه ای در حین کار با اتیدیوم بروماید مسئول ایمنی یا مسئول آزمایشگاه را در جریان قرار دهید.
واکنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction
واکنش زنجیرهِ پلی مراز یک روش آزمایشگاهی است که به منظور تولید انبوه قطعه خاص و انتخابی از DNA به کار میرود. واکنش مبتنی بر تکثیر آنزیمی قطعهای از DNA است که با استفاده از دو آغازگر چند نوکلئوتیدی که مکمل پایانه ’ 5 هر دو رشته مورد نظر هستند، صورت میگیرد تا کپی شدن الگوی DNA توسط آنزیم پلیمراز امکان پذیر شود. PCR از نظر اصولی عملی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است. به طورکلی دو فرق بین PCR و همانندسازی وجود دارد:
همانندسازی در بدن در دمای 37 درجه سانتیگراد با آنزیم DNA پلی مراز و آنزیمهای دیگر صورت میگیرد در PCR به علت نیاز به درجه حرارت بالا جهت واسرشت شدن از آنزیم مقاوم به حرارت همانند Taq استفاده میشود و به جای سایر آنزیمها ازتغییرات درجه حرارت استفاده میشود.
امروزه تکنیک PCR جایگاه رفیع و بسیار مهمی را در جنبههای مختلف مهندسی ژنتیک، بیولوژی مولکولی، میکروبشناسی تشخیصی، تشخیص سرطان و بیماریهای ژنتیکی، تشخیص هویت، جرم شناسی )پزشک قانونی جهت تشخیص منشاء نمونه اسپرم، خون و …( باستان شناسی، مطالعات تکاملی موجودات وغیره پیدا کرده است.
مکانیسم:
در این تکنیک اصول همانند سازی DNA داخل سلول در لوله تقلید و تکرار می گردد. DNA پلی مراز، DNA تک رشته ای را از جهت ´5 به´3 به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد و رشته مکمل را در جهت 3´ به5´ می سازد. همچنینDNA پلی مراز برای شروع احتیاج به یک قطعه اولیه یا پرایمر (Primer) دارد.
به طور کلی پرایمر یک قطعه اولیگونوکلئوتیدی کوچک است که انتهای 3´OH را برای شروع همانند سازی DNA پلی مراز فراهم می کند.
تکنیک PCR شامل سیکل های تکرار شونده ای است که در آن به کمک یک سری پرایمر، و با کمک آنزیم از روی یک DNA الگو، عمل همانند سازی انجام می گیرد. این پرایمرها، مکمل بخش هایی از DNA هدف هستند. پرایمرها زمانی که دو رشته DNA به وسیله حرارت، دناتوره شود با کاهش دما در مرحله بعد به سکانس های خاص مکمل خود می چسبند (Anneal) .
برای شکستن هر باند A=T ، دو درجه سانتیگراد، و برای شکستن هر باند G=C ، چهار درجه سانتیگراد حرارت لازم است که به آن اصطلاحاً دمای ذوب (Melting Temperature, Tm) میگویند. اما برای این که C به G و A به T باند شود، با توجه به مشخصات پرایمر مورد استفاده، حرارت مورد نیاز را تعیین مینمایند. DNA دو رشته ای به وسیله حرارت از هم باز میشوند و چون غلظت پرایمر زیاد است وصل شدن پرایمر به مکملش انرژی نمیخواهد و به راحتی به مکمل خود میچسبد.
به طور کلی هر سیکل PCR شامل سه مرحله است:
مرحله باز شدن یا واسرشت شدن دو رشتهDNA ( Denaturing step )
DNA دو رشته ای در اثر حرارت در حضور پرایمرها، چهار dNTP و DNA پلی مراز مقاوم به حرارت باز می شود. دناتوراسیون حرارتی به طور معمول در طیف دمایی 93 تا 100 درجه سانتیگراد انجام میشود.
چسبیدن پرایمرها به هدف (Annealing step )
با کاهش دما به 37-65 درجه سانتیگراد( بسته به Tm پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی(، پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی به DNA هدف دناتوره شده میچسبند.
ساخت رشته مکمل هدف(Extension step)
آنزیم DNA پلی مراز مقاوم به حرارت به دنبال پرایمر ها و با استفاده از سکانس هدف، عمل پلیمریزاسیون را در 72 درجه سانتیگراد انجام میدهد.
یک پروتکل تیپیک PCRشامل 25-40سیکل حرارتی است. از نظر تئوری، در هر سیکل تعداد سکانس های هدف دو برابر میشود. بنابراین تکرار سیکلهای حرارتی باعث افزایش سکانس هدف به شکل تصاعدی میگردد.
در سیکل اول اندازه دو رشته به وجود آمده بزرگتر از سکانس واقعی موردنظر است. چرا که در فرمان داده شده جهت ساخت رشته مکمل، DNA پلی مراز از انتهای سکانس مورد نظر جلوتر رفته، محصول PCR بزرگتر از سکانس مورد نظر را تولید میکند با این وجود، بعد از سیکل دوم، فرآوردههای حاصل دارای اندازه مورد نظر هستند که به آنها محصول کوتاه (Short PCR Product of PCR) هم گفته میشود. هم اندازه با طول سکانس مورد نظر هستند )یعنی از ابتدای پرایمر دوم).