بهینه سازی و نگهداری

دانلود پایان نامه

مواد مورد نیاز برای انجام واکنش PCR
dNTP ها از شرکت سیناژن تهیه شدند که حاوی 500 میکرولیتر از محلول ترکیب شده نوکلئوتیدهای dGTP و dTTP و dATP و dCTP با غلظت 10 میلیمول بودند. نگهداری آنها در فریزر 20- صورت گرفت.
کلرید منیزیم(MgCl2)
محلول کلرید منیزیم از شرکت سیناژن تهیه شد. این محلول با غلظت 50 میلیمول و بدون رقیق کردن مورد استفاده قرار گرفت. به ازای هر نمونه در واکنش 25 میکرولیتری، 1 میکرولیتر از این محلول استفاده شد.
بافر واکنش PCR
بافر واکنش از شرکت سیناژن تهیه شد. بافر واکنش حاوی 500 میلیمول کلرید پتاسیم و 200 میلیمول تریس- اسید کلریدریک با PH=8 بود. غلظت این محلول به صورت 10X میباشد و بدون رقیق کردن در واکنش PCR استفاده میشود. بافر واکنش نیز در فریزر 20- نگهداری شده و قبل از استفاده ذوب شده و پس از استفاده دوباره به فریزر 20- منتقل میشود. به ازای هر نمونه در واکنش 25 میکرولیتری، 5/2 میکرولیتر از این محلول استفاده شد.
آنزیم Taq Polymerase
تیوب این آنزیم حاوی 100 واحد از این آنزیم است. این آنزیم بطور مستقیم در واکنش PCR مورد استفاده قرار میگیرد. نگهداری این آنزیم در فریزر 20- درجه سانتیگراد است و برای استفاده بایستی بر روی یخ قرار گیرد. به ازای هر نمونه در واکنش 25 میکرولیتری 3/0 میکرولیتر استفاده میشود.
آب دوبار تقطیر شده استریل
از آب مقطرهای درون شیشههای آمپول که به صورت استریل و دوبار تقطیر شده عرضه میگردد، استفاده میشود.
به جای مواد بالا نیز گاهی از مستر میکس آماده نیز استفاده شده که از شرکت به آزما خریداری شده و حاوی همهی مواد بالا نیز میباشد و فقط کافی است به آن پرایمرها و نمونه DNA را بزنیم.
پرایمر(آغازگر)
همان طور که در توضیح مکانیسم PCR 24 بازی می باشند که به نقاط مکمل گفته شد، پرایمرها یک رشته نوکلئوتیدی 18 خود بر روی رشته الگو متصل شده و سبب مشخص شدن ناحیه تکثیر مورد نظر می شوند. در واقع علاوه بر عمل گفته شده، پرایمر ها گروه –OH 3′ مورد نیاز جهت عمل پلی مرازی آنزیم را در واکنش PCR فراهم میآورند. در طراحی و بهینه سازی پرایمرها مواردی باید رعایت شود تا بتوانیم از اتصالات غیر اختصاصی جلوگیری نماییم. مشخصات پرایمرهای RAPD در جدول 3-4 نشان داده شده است.
جدول 3-6 مشخصات پرایمرهای RAPD
جدول ‏34 مشخصات پرایمرهای RAPD
دمای ذوب (c˚)
توالی
نام آغازگر
34
‘-GTGAGGCGTC-3’5
OPC-02
32
‘-AAAGCTGCGG-3’5
OPC-11