تغییرات ساختاری و پایداری

دانلود پایان نامه

Evaluation of the changes in enzyme structure and
protein denaturation indicated by the loss of a
and b structures
CD
Gonçalves et al., 1999; Petersen et al., 1998;
Zoungrana et al., 1997
Determination of enzyme denaturation temperatures
(TM) and enthalpy (DDH) in different conditions
DSC
Gonçalves et al., 1998a
Titration of system components to study its interaction
with protein
ITC
Egmond et al., 1996; Melo et al., 1996a, 1997
Monitoring of protein unfolding by detection of changes
in tyrosyl ionization
UV absorbance

از کالریمتری اسکن دمایی (DSC) و CD و کالیمتری هم دما (ITC) و جذب uv برای توصیف ساختار دوم و سوم کوتیناز و همچنین برای توجیه خواص کاتالیزوری آن و فرایندهای پایداری و دناتوراسیون استفاده شده است. ثابت شده است که DSC یک ابزار مفید به منظور بررسی پایداری حرارتی پروتئینها با استفاده از دمای گذار مرتبط با تغییرات کنفورماسیونی است. با استفاده از این روش پترسون و همکاران ثبات ساختار سه بعدی کوتیناز در محدودهpH 4تا 9 را تایید کردند، در صورتی که هیچ فعالیتی درpH 4 تا 5 مشاهده نشده است. دلیل این رفتار چگونگی یونیزاسیون هیستیدین-188 است. این رزیدو به منظور ایجاد ثبات در سرین کاتالیزوری دپروتونه شده است. تیروزین در نزدیکی جایگاه فعال در pH 8.5 در بیان کردن پتانسیل الکتروسترواستاتیک منفی کمک میکند ( حداکثر pH فعالیت pH 8.5 است). ثبات بالای کوتیناز قارچی ، در مقادیر pHاسیدی و بازی ،در مقابل کوتیناز گرده که فقط در pH خنثی پایدار است، نشاندهنده pH بهینه برای فعالیت برابر 6.8 است.
CD اجازه مطالعه ساختار سوم را در محدوده UV نزدیک را میدهد در حالی که UV دور اجازه ارزیابی تغییرات ساختاری ثانویه در پروتئین را میدهد. طیف CD از کوتیناز حل شده و جذب شده بر روی SiHG-40 نشان داده است که میزان ساختار مارپیچی به شدت با تماس با سطح سیلیکا کاهش مییابد. از این رو به نظر میرسد که نیروی محرکه مهم برای جذب افزایش در انتروپی کنفورماسیونی است.
از ITC نیز استفاده شده تا طبیعت میانکنشهای رخ داده بین سورفاکتانتها، الکلها و ترکیبات دیگر و اثر آنها بر فولدینگ کوتیناز را مطالعه کنند. اثر pH بر دناتوراسیون کوتیناز به کمک جذب UV در محلولهای آبی که با تغییرات جذب تیروزین دنبال میگردد تایید شده است. دمای نقطه میانی منحنی unfolding حرارتی در pH 6/9 بالاتر از pH7/10 است و در نتیجه ناپایداری کوتیناز طبیعی در pH های بالاتر اثبات میشود [50].
عملکرد کوتیناز
مطالعه عملکرد کوتیناز با تعریف ساختار آن مرتبط است و چندین روش به منظور مطالعه عملکرد کوتیناز به کار گرفته شده است (جدول 2-1) [51, 52]. این نشان می دهد که در کوتیناز دو پاکت اتصال مختلف ممکن است وجود داشته باشد یکی به استر یا زنجیره کوتاه و دیگری به استر یا زنجیره طولانی تر متصل میشود و این امر در مورد الکل ها خواهد بود. با این حال اخیرا مطالعات اشعه ایکس با استفاده از زنون و کریپتون برای ترسیم حفره آبگریز می توانست تنها یک جایگاه اتصالی منفرد را در سطح کوتیناز آشکار کند که پیشنهاد میدهد که تعدادی از میانکنشها در سطح کوتیناز ممکن است در جایگاه غیر اختصاصی رخ دهد [53]. مطالعه استرئولیپازها در محدوده تری و دی اسیل گلیسرول با استفاده از تکنیک تک لایه برای تکمیل اطلاعات ساختاری انجام شد [54]. نتایج بدست امده با تری آسیل گلیسرولprochiral نشان داد که کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی یک ترجیح استری مجزا را برای موقعیت sn-3 نمایش می دهد جهش زایی هدفدار به عنوان یک ابزار مهم برای ازمایش و اثبات اثرات میانکنشهای کارکردی کوتیناز با انواع مختلف سوبستراها و تعریف ساختار و به ویژه اتصالات جایگاه فعال استفاده می شود. Manesse و همکاران (1995) از انالوگ های تری گلیسیرید در ارتباط با کوتیناز و جهش یافته های ان همانطور که قبلا اشاره شده بود استفاده کردند[55]. نمونههای A85F و A85W افزایش فعالیت نشان دادند که نشان دهنده میانکنش اثر متقابل بین استر زنجیره اسیل و باقیماندههای 80-90 از انزیم میباشد. جهش برای روشن کردن نقش اسیدهای آمینه در پایدارسازی حدواسطهای پروتئینی مفیداند. جهش سرین-42 با آلانین منجر به کاهش قابل توجهی در فعالیت می شود که نشاندهنده اهمیت این سرین برای پایداری حفره اکسی انیون است. جهش های N84W و N84D نیز برای مطالعه اثرات فضایی و الکترواستاتیک در کوتیناز ساخته شده است [47]. به منظور بهبود دانش ساختار کوتیناز ، جهش سرین توسط سیستئین انجام شده است [43] که به دلیل دسترسی به سطح و خصوصیت ایزوستریک این جهش، منجر به تشکیل کریستال های میشود. اخیرا جهش زایی هدفدار روی بهبود تولید و پایداری کوتیناز تمرکز کرده است.
کاربردهای کوتیناز