تغییر رنگ و انتخابی

دانلود پایان نامه

الکتروفورز DNA روش سریع و متداولی برای تعیین کیفیت DNA است. برای تهیه ژل آگارز 1% برای الکتروفورزهای مختلف به شرح زیر عمل گردید.
1. الکتروفورز سایز کوچک: 3/0 گرم از پودر آگارز را در 30 میلیلیتر TBE(1X)مخلوط میکنیم.
2. الکتروفورز سایز متوسط: 6/0 گرم از پودر آگارز در 60 میلیلیتر TBE(1X) مخلوط میکنیم.
3. الکتروفورز سایز بزرگ: 1 گرم از پودر آگارز در 100 میلی لیترTBE(1X) مخلوط میکنیم.
سپس این مخلوط را در مایکروفر در دمای متوسط به مدت حداقل 3 دقیقه و حداکثر 5 دقیقه، قرار داده تا در نهایت محلول شفافی حاصل شود (شکل 3-1). سپس ژل را در سینی مخصوص الکتروفورز که شانه از قبل بر روی آن تنظیم شده است، ریخته شده تا ژل محکم و سفت شود. نشانه بستن ژل تغییر رنگ آن است که از حالت شفاف به حالت کدر سفید رنگ تبدیل میشود. سپس سینی را در تانک اصلی الکتروفورز قرار داده، بافرTBE(1X) در تانک ریخته شود. حجم بافر TBE(1X)برای تانک الکتروفورز کوچک 500 میلیلیتر، برای تانک الکتروفورز متوسط 700 میلیلیتر و برای تانک الکتروفورز بزرگ 900 میلیلیتر میباشد. سپس شانه به آرامی از ژل جدا میشود. برای بارگذاری نمونهها 5 میکرولیتر از محصول PCR با 2 میکرولیتر از Loading Buffer تهیه شده از شرکت سیناژن مخلوط کرده و سپس با استفاده از سمپلر کریستالی 2تا20 میکرولیتر یا سمپلر 5/0 تا 10 میکرولیتر درون چاهکهای ژل ریخته و بر اساس دستگاه الکتروفورز انتخابی (کوچک،متوسط،بزرگ) زمان بارگذاری از 50 دقیقه تا 3 ساعت طول کشید. ولتاژ مورد استفاده برای الکتروفورز 96 ولت بود. برای اندازهگیری سایز باندها از Ladder 100kb که از شرکت سیناژن تهیه شده بود، استفاده گردید. میزان لدر مورد استفاده 5 میکرولیتر بود. پس از اتمام مرحله الکتروفورز ژل به مدت 15 تا 20 دقیقه در محلول اتیدیوم برماید که به صورت 60 میکرولیتر از استوک محلول اصلی اتیدیوم برماید که با 400 میلی لیتر آب رقیق شده بود، قرار داده شد و سپس با استفاده از دستگاه ژل داک باندها مشاهده شد. مشاهده باندهای قوی نشاندهنده کیفیت مطلوب DNA استخراج شده است. وجود لکههای ممتد و اسمیری شدن در ژل نشاندهنده کیفیت نامناسب DNA میباشد. مواد مورد استفاده برای تهیه بافر TBE(10X) در ‏جدول 3-3 آمده است.
آ. حل کردن پودر آگارز
ب. شفاف شدن ژل اگارز پس از حل کردن پودر آگارز
شکل ‏31 تهیه ژل آگارز
جدول ‏33 مواد مورد استفاده برای تهیه بافر TBE(10X)
مقدار
نام ماده
8/10گرم
Tris-Base
4/5گرم
Boic acid
74/0گرم
EDTA
در این تحقیق برای تهیه ژل آگارز و بارگذاری DNA ، از بافر TBE(10X) استفاده شده است.
لازم به ذکر است که برای الکتروفورز از همان بافری استفاده شود که در ساختن ژل از آن استفاده شده است. در الکتروفورز علاوه بر بافر TBE(Tris-Borate-EDTA) ، از بافر TAE (Tris-Acetate-EDTA) نیز استفاده میشود.
رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید:
دستگاه gel documentation دارای قسمتهای مختلفی است. یک ترانس لومیناتور UV دارد که ژل پس از رنگ آمیزی بر روی آن قرار میگیرد. تابش UV به ژل باعث می شود که اسیدهای نوکلئیک قابل مشاهده گردند. این دستگاه مجهز به یک دوربین دیجیتال با فیلتر UV است و قادر است از ژل عکس بگیرد. سپس این عکس به کامپیوتر متصل به دستگاه منتقل شده و نتایج بررسی میگردد.
نکات مهم در مورد استفاده از اتیدیوم بروماید: 
این ماده موتاژن و سرطانزاست. از طریق پوست، چشم و دستگاه تنفسی می تواند نفوذ کند.
– هنگام کار با اتیدیوم بروماید از دستکش های پلاستیکی و عینک های محافظ و ماسک استفاده کرد.