سانتریفیوژ و استخراج

دانلود پایان نامه
دستگاه انکوباتور مدل Memmert
هود لامینار مدل BEASAT-BSC126
دستگاه اسپکتوفوتومتر مدل Varian cary 50 UV- visible
آون Binder
ترازوهای معمولی و دیجیتال مدل Mehlern Toledo
بنماری Memmert
ورتکس
اسپین
هیتر Heidolph, (Heater stirrer)
الکتروفورز
PCR ترموسایکلر مدل Hielscher
Gel doc مدل Cyngene
PH متر
سانتریفیوژ مدل NAPCO-2028R
وسایل دیگر آزمایشگاهی که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند شامل موارد زیر می باشند:
میکروتیوپ، فالکون، سمپلر، سر سمپلر،پتری دیش، ارلن، بشر، استوانه مدرج، لوله آزمایش، شیشههای درب آبی، قاشقک، لوپ،مگنت
استخراج کوتین
در اولین مرحله شناسایی گونههای تولیدکننده آنزیم کوتیناز، نیاز به تهیه سوبسترای کوتین میباشد. با توجه به عدم در دسترس بودن کوتین در بازار لازم بود که آن را از میوهها تهیه کنیم. به این منظور میوههای سیب قرمز، سیب زرد، گوجهفرنگی و خیارسبز از سوپرمارکت خریداری شدند. میوهها شستوشو داده و وزن گردیدند آنگاه پوست میوهها را جدا کرده و بعد از وزن کردن پوست میوهها، آنها را در بافر اگزالات (2گرم اگزالیک اسید، 8گرم آمونیوم اگزالات، 500 میلی لیتر آب) به مدت 4 ساعت جوشانده شد تا پالپها کاملا جدا شوند پوست میوهها را فیلترکرده و با آب مقطر شستوشو داده و وزن کرده و سپس پوستها را در آون 40 درجه سانتیگراد خشک کرده و آسیاب میکنیم. پودر بدست آمده را در محلول کلرفرم متانول به نسبت2 به 1 (60 میلیلیترکلروفرم، 30 میلیلیتر متانول) میریزیم و به مدت 12 تا 24 ساعت روی شیکر قرار میدهیم و سپس به محلول بدستآمده آب اضافه کرده و در دستگاه سانتریفیوژ با دور 12000 و به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند سه فاز در این حالت تشکیل میشود که فازهای رویی را دور ریخته سپس فاز زیری را جدا میکنیم. فاز زیری را درون پتری ریخته و پتری را در آون 80 درجه سانتیگراد خشک میکنیم. پودر بدست آمده همان کوتین است [56].
نمونه برداری
نمونههای قارچی و باکتریایی از پوست میوه و خاک باغچه (مرطوب و از برگهای در حال تجزیه) نمونه معمولی خاک سطح برگ یا میوههای مشکوک به آلودگی تودهی باکتری ، ورمیکمپوست جمعآوری شد.
غربالگری و جداسازی گونههای تولیدکننده آنزیم کوتیناز
به منظور غربالگری و جداسازی سریع نمونههای تولید کننده آنزیم کوتیناز از محیط کشتی باید استفاده گردد که کوتین تنها منبع کربن آن برای استفاده میکروارگانیزمها باشد و تنها میکروارگانیزمهایی در این محیط رشد کنند که قادر به تجزیه کوتین باشند.
این محیط کشت حاوی ترکیبات زیر است:
03/0 گرم سدیمکلرید، 03/0 گرم آهننیترات، 03/0گرم پتاسیمکلرید، 5/0 گرم آمونیومکلرید، 01/0 گرم آهنسولفات، 06/0 گرم پتاسیمدیهیدروژن فسفات، 02/0 گرم منیزیمسولفات. این مواد را در 100 میلی لیترآب حل کرده سپس pH محیط را به 2/7 رسانده و به آن 4/0 گرم کوتین اضافه کرده و اتوکلاو شد[57].