سانتریفیوژ و شیمیایی

دانلود پایان نامه

نمونه: در یک ویال 700 میکرولیتر بافر یک، 100 میکرولیتر بافر دو و 200 میکرولیتر از نمونه موجود در محیط مایع سانتریفیوژ شده مرحله قبل میریزیم.
به منظور تهیه Blank : 200 میکرولیتر از هر نمونه موجود در فالکون را در یک ویال میریزیم به مدت 5 دقیقه در آب در حال جوش میگذاریم سپس به انها 700 میکرولیتر بافر یک و 100 میکرولیتر بافر دو میریزیم.
بعد از تهیه نمونه و Blank به منظور تست دوم شناسایی باکتریهای دارای فعالیت کوتینازی، نیم ساعت صبر کرده و میزان جذب نمونهها را میخوانیم. نمونههای دارای جذب، نشان دهنده وجود انزیم کوتیناز در آنها میباشد [84].
Assay ویژه آنزیمی
از نمونههای غربالگری شدهای که قبلا ثابت شده است فعالیت آنزیمی دارد استفاده میکنیم.
بدین منظور برای سنجش فعالیت آنزیم 80 میکرولیتر از گلیسرول حاوی این نمونهها را از یخچال 80- برمیداریم و به 5 میلی لیتر از محیط LB انتقال میدهیم به مدت یک روز در شیکر انکوباتور گذاشته و سپس 5 دقیقه با دور 4000 دور سانتریفیوژ میکنیم در مرحله ی بعد سوپ رویی را دور میریزیم و مابقی را به 5 میلی لیتر محیط کشتی که کوتین تنها منبع کربن آن برای استفاده میکروارگانیسمها است انتقال میدهیم و به مدت 4 تا 5 روز در شیکر انکوباتور با دمای 30 درجه و 150rpm انتقال میدهیم. مانند مرحله قبل، در یک ویال نمونه و در یک ویال Blank را تهیه میکنیم و از لحظه صفر تهیه نمونه به مدت نیم ساعت، هر یک دقیقه یکبار میزان فعالیت آنزیم را بررسی میکنیم. در نهایت دادهها را وارد excel کرده و از طریق معادلات انزیمی میزان فعالیت هر آنزیم را محاسبه میکنیم.
استخراج DNA
به منظور استخراج DNA جهت انالیز 16sDNA و نشانگر RAPD از روشهای مختلفی از قبیل جوشاندن،CTAB و کیت استفاده شد که مراحل هر کدام در زیر امده است.
استخراج DNA به روش جوشاندن
30 میکرو از گلیسرول مایع را به 5 میلی لیتر از محیط LB تلقیح میکنیم به مدت 24 ساعت در شیکر انکوباتور 30 درجه سانتیگراد با 150rpm قرار میدهیم و سپس 1 میلی لیتر از هر کدام را در ویال ریخته و به مدت 5 دقیقه rpm 1000سانتریفیوژ میکنیم فاز رویی را دور ریخته و 200 ماکرو آب دوبار تقطیر به آنها اضافه میکنیم و ورتکس میکنیم تا کامل حل شود و سپس 15 دقیقه در اب 90 درجه گذاشته و سپس 5 دقیقه در روی یخ میگذاریم و سپس 15 دقیقه آب 90 درجه و 5 دقیقه یخچال 80- و در نهایت برداشته و به مدت 5 دقیقه با ده هزار دور سانتریفیوژ میکنیم سوپرناتانت رویی را که همان DNA است را بر میداریم و در یخچال 20- درجه قرار میدهیم.
استخراج DNA به رو ش CTAB
قبل از انجام مراحل استخراج DNA، محلولها و بافرهای مورد نیاز به شرح زیر تهیه شدند.
1. نیتروژن مایع
2. بافر استخراج CTAB: (100میلیلیتر Tris-HCl 1مولار با PH=8، 280میلیلیتر NaCl 5مولار، 40 میلیلیتر5/0 EDTA مولار، 20 گرم CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) به حجم نهایی 1 لیتر رسانده شود.
3. کلروفرم – ایزو آمیل الکل به نسبت 24 به 1
4. ایزو پروپانول 100%
5. اتانول 100%
6. استات آمونیوم 5/7 مولار
7. محلول TE: (میلیلیتر Tris-HCl 1مولار با PH=8،2 میلیلیتر EDTA 0.5 مولار و با H2O دوبار تقطیر شده به حجم 1 لیتر برسد).
مشخصات کامل مواد شیمیایی مورد نیاز در عملیات استخراج DNA در ‏جدول 3-2 شرح داده شده است
.
جدول ‏32 مشخصات کامل مواد شیمیایی مورد نیاز در عملیات استخراج DNA
نام اختصاری
نام کامل