شیمی درمانی و وجود رابطه

دانلود پایان نامه

شیمی درمانی و رادیوترپی باعث افزایش آسیب DNA اسپرم می شود. در این بیماران علاوه بر افزایش میزان آسیب DNA به علت شیمی درمانی، آندوکرینی بیضه نیز تحت تاثیر قرار گرفته و منجر به آزواسپرمی می شود. در این بیماران انجماد اسپرم پیشنهاد می گردد(Howell & Shalet, 2005).
1-11-4- سن
از دیگر عواملی که می تواند بر قطعه قطعه شدن DNA اثر گذارد ، سن است. تحقیقات نشان داده است که در افراد مسن میزان قطعه قطعه شدن DNA و سقط های خود به خودی افزایش می یابد(Kleinhaus, et al., 2006).
1-12- تکنیکهای بررسی ساختار کروماتین
میزان موفقیت تکنیک باروری به سلامت کامل تخمک و اسپرم وابسته است. در دهه 1980 و 1990 میلادی تحقیقات زیادی در زمینه لقاح و تحریک تخمکگذاری به انجام رسید، ولی در مردان فقط به وجود اسپرم اشاره شد و تحقیقات زیادی در مورد سلامت و عملکرد آن صورت نگرفت.
با پیشرفت تکنیک ICSI نقش اسپرم در تکامل و تکوین جنین مشخص شد. تحقیقات زیاد در این راستا منجر به بررسی تستهای عملکردی اسپرم و ارتباط آنها با باروری شده است. وضعیت کروماتین اسپرم از جمله مباحثی است که بیشتر به آن پرداخته شده، زیرا اسپرم نه تنها در فعالسازی تخمک مؤثر است، بلکه نیمی از ژنوم نسل آینده توسط اسپرم منتقل میشود و سلامت آن، جهت تکوین جنینی اهمیت بالایی دارد. در این میان بررسی سلامت DNA اسپرم از اهمیت خاصی برخوردار است که از دلیل اهمیت آن میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
1)وجود رابطه معکوس بین پارامترهای اسپرم و آسیب DNA
2) افزایش آسیب DNA در افراد نابارور
3)‌ وجود رابطه معکوس بین میزان لقاح و آسیب DNA
4) افزایش سقط در بیماران با آسیب DNA بالا.
لذا، با توجه به اهمیت سلامت DNA اسپرم در باروری در این قسمت به روشهای بررسی ساختار کروماتین پرداخته میشود.
1-12-1- روشهای تعیین آسیب DNA اسپرم انسان
صرف نظر از نحوه ایجاد آسیب در DNA، روشهای متفاوتی جهت تشخیص میزان این آسیبها وجود دارد. برای ارزیابی آسیب DNA اسپرم دو روش مختلف در نظر گرفته شده است:
1)روشی که شکستگیهای DNA را هم به صورت تک رشته یا دو رشته تعیین میکنند. روش TUNELاست و، لازم به ذکر است که شکستگی در DNA حساسیت DNA را به دناتوره شدن افزایش میدهد.
2) روشهایی که سلامت کروماتین اسپرم را با اندازهگیری حساسیت کروماتین و مخصوصاً DNA نسبت به دناتوره شدن تحت تیمارهای خاص ارزیابی میکند. مانند SCSA، CMA3، DBD-FISH، Comet و SCD. تستهای دیگری نیز برای ارزیابی کروماتین اسپرم وجود دارد که در ادامه به آن اشاره خواهد شد.
1-12-1-1- تست TUNEL
این روش در ابتدا برای تشخیص جمعیت اسپرمهای دچار آپوپتوز در نمونههای انزالی به کار برده شد. در این روش شکستها در یک یا دو رشته DNA قابل تشخیص است. در این روش نوکلئوتیدهای نشاندار شده، نوکلئوتیدهای انتهایی رشته DNA شکسته شده را مورد هدف قرار میدهند. این واکنش توسط یک پایانه ترانسفرازی کاتالیز میشود که دی اکسید یوریدین تغییر یافته را با بیوتین یا Digoxigenin در پایانه OH 3′ از رشتهای که شکسته شده، ترکیب میکند. سپس نوکلئوتیدهای تغییر یافته توسط آنتی بادی فلور سنت نمایان میشوند. نوکلئوتید مستقیماً با فلئوکروم نشاندار میشود. جهت تشخیص فلورسنت در اسپرمها میتوان از میکروسکوپ فلورسنت یا از دستگاه فلوسایتومتری استفاده کرد. رنگ فلورسنت مشاهده شده در هر اسپرم، نشانگر شکستگی در رشته یا رشتههای DNA است(EI, et al., 2007) .
1-12-1-2- روش DBD-FISH
این روش که زمان زیادی از ابداع آن نمیگذرد بیشتر در فعالیتهای تحقیقاتی کاربرد دارد. جهت تشخیص و بررسی میزان شکستگیها در DNA اسپرم ابتدا ساختار DNA را با تغییر غلظت PH دناتوره کرده و سپس با مواد قلیایی باعث جدا شدن محلهای شکسته شده از یکدیگر در ساختار DNA میشود. پس از دناتوره شدن و خارج شدن پروتئینها با استفاده از محلول لیز کننده، تکرشتههای شکسته شده با پروب DNA هیبرید میشوند. با استفاده از این روش میتوان میزان شکستگی DNA را به صورت شاخص DNA fragmentation بیان کرد. همانند روش قبل، این روش جهت استفاده کلینیکی مناسب نیست. همچنین این روش تنها روشی است که ارزیابی آسیب را، سلول به سلول، در جایگاهی از توالی خاص DNA انجام میدهد(Fernández & Gosálvez, 2002).
1-12-1-3- روش Comet
یکی دیگر از روشهای مفید جهت بررسی آسیب DNA در یک یا دو رشته آن، روش Comet است. پیش از این برای انجام این روش از شرایط بافری خنثی برای شکستگیهای دو رشته DNA استفاده میشد. سپس با کمی تغییرات از بافر الکتروفورز قلیایی جهت بالا بردن حساسیت DNA یک و دو رشتهای نسبت به شکستگیها استفاده شد. با استفاده از این روش میتوان علاوه بر تشخیص انواع مختلف فراگمنتاسیون DNA، مانند نکروز و آپوپتوز، میزان شکستگیها را نیز تشخیص داد. اساس این تکنیک شناسایی شکستگیها در یک یا دو رشته DNA با استفاده از دستگاه الکتروفورز است(Duty, et al., 2002).
1-12-1-4- رنگآمیزی CMA3
کرومومایسین A3(CMA3) به عنوان یک رنگ فلورسنت در تحقیقات سیتو ژنتیک استفاده میشود. با استفاده از این رنگآمیزی میتوان به صورت غیر مستقیم ساختار کروماتین را مورد بررسی قرار داد. این ترکیب جهت اتصال به شیار بزرگ در ساختار DNA با مولکول پروتامین رقابت میکند. بنابراین، این تکنیک مشخص کننده نقص در بستهبندی کروماتین (کمبود پروتامین)، بلوغ هسته و متراکم شدن هسته است. نتایج مطالعات مختلف نشان داده که ارتباط معنیداری بین کمبود پروتامین بررسی شده به روش رنگآمیزی CMA3 در اسپرم و میزان لقاح در بیماران کاندیدا ICSI و IVF وجود دارد(Iranpour, Nasr-Esfahani, Valojerdi, & Taki Al-Taraihi, 2000).
شکل 1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: A.TUNEL, B.COMET, C.CMA3