عوامل محیطی و ماهواره ها

دانلود پایان نامه

نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR
این دسته از نشانگرهای DNA بدون استفاده از روش PCR تولید و مورد استفاده قرار میگیرند. سرگروه این دسته از نشانگرها، نشانگر تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیمهای محدودکننده میباشد که RFLP نامیده میشود.
در اوایل دهه 1980 بوتستاین و همکارانش روش تفاوت طول قطعات قابل هضم یا RFLP را برای مطالعه مستقیم DNA و یافتن نشانگرهای ژنتیکی جدید پیشنهاد و معرفی نمودند. از میان نشانگرهای مولکولی مختلف ابداع شده، RFLP ها در زمره اولین نشانگرهای مولکولی بودند که در پروژههای مختلف ژنوم گیاهان و جانوران به کار رفتهاند. به همین دلیل به نشانگرهای مولکولی نسل اول هم موسوم میباشند. RFLP ها در اثر تغییرات توالی DNA مانند اضافه شدن یا حذف شدن قطعات DNA، نوآرایی و جهشهای تک نوکلئوتیدی ایجاد میشوند. این تغییرات سبب ایجاد، از دست رفتن یا جابجایی برخی جایگاههای برشی میشود که اساس ایجاد RFLP ها میباشد. در این روش DNA ژنومی توسط آنزیم محدودگر خاصی هضم میشود و سپس بر روی ژل آگارز از هم جدا میشوند. سیستم آللی یا جهشهای ژنتیک از تفاوت طول قطعات حاصل از هضم شناخته میشوند. اگر دو نمونه گیاهی را در نظر داشته باشیم که فقط یک نوکلئوتید آنها در نقطه برش خاصی باهم متفاوت باشند، آنزیم محدودگر ویژه آن نقطه برش، DNA مستخرج از یکی از آن دو را برش خواهد داد و DNA نمونه دیگر در آن نقطه بدون برش باقی خواهد ماند. به این ترتیب قطعات حاصل از برش توسط آنزیمهای محدودگر دارای طول متفاوت خواهد بود. اثبات شده است که این نشانگرها برای تعیین ژنوتیپ کارآمد و دقیق میباشند. از محاسن این نشانگر میتوان تکرار پذیری بالا، فراوانی زیاد، همبارز بودن نام برد. همچنین این نشانگر تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صددرصد ژنتیکی است. از معایب این نشانگر میتوان به دشواری، پیچیدگی، نیاز به کاربرد مواد رادیواکتیو و نیاز به مقدار نسبتا زیادی DNA اشاره کرد.
نشانگرهای مبتنی بر PCR
واکنش زنجیرهای پلیمراز برای اولین بار در سال 1985 توسط سیکی و همکاران معرفی شد. واکنش زنجیرهای پلیمراز که بطور اختصار PCR خوانده میشود روشی قوی میباشد که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول یک ژنوم را تا چندین میلیون برابر در مدت کمتر از نیمروز امکانپذیر میکند. اما از این روش زمانی میتوان استفاده کرد که حداقل ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه DNA موردنظر معلوم باشد. در این فرایند که تقلیدی از فرایند همانندسازی DNA در طبیعت میباشد، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه موردنظر DNA میباشند، به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار میگیرند تا واکنش همانندسازی انجام گیرد. این همانندسازی یک فرآیند آنزیمی بوده و توسط انواع مختلفی از آنزیمهای پلیمراز صورت میگیرد. نشانگرهای مبتنی بر PCR به دو دسته نشانگرهای اختصاصی و نشانگرهای غیر اختصاصی تقسیم بندی میشوند [82].
PCR یا واکنش زنجیرهای پلیمراز:
فرایند PCR از سه مرحله مشخص تشکیل شده است. که این مراحل به وسیله تغییر در درجه حرارت، هر مرحله تعیین میشود. در مرحله اول DNA دورشتهای واسرشته شده و دو رشته از هم جدا میشوند. در مرحله دوم درجه حرارت پایین میآید تا حدی که اتصال آغازگر به الگو را امکانپذیر سازد. در حین مرحله اتصال آغازگر به الگو آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت فعال میشود و شروع به بسط آغازگرها میکند. در مرحله سوم درجه حرارت دوباره افزایش مییابد تا اینکه به یک حد مناسب جهت فعالیت پلیمرازی آنزیم DNA پلیمراز برسد. اگر PCR با کارایی 100درصد انجام گیرد، در طی 20 چرخه یک میلیون نسخه از DNA موردنظر تولید میشود.
نشانگرهای غیر اختصاصی
RAPD
این روش در سال 1990 توسط دو گروه ویلیامز و همکاران و ولش و مکلند ارائه شد. در این روش از آغازگرهایی به طول 8 تا 10 نوکلئوتید که ردیف بازی آن بطور قراردادی تعیین میشود، استفاده میگردد. در این واکنش یک آغازگر منفرد نقاط ممکن خود را روی دو رشته متقابل DNA ژنومی نمونهها یافته و در آن نقاط بر روی دو رشته مکمل DNA متصل میشود. اگر محل اتصال آغازگرها در روی دو رشته متقابل بهم نزدیک باشند، ردیف بین آن دو نقطه اتصال طی واکنش PCR تکثیر خواهد شد. پلیمورفیسم در RAPD به شکل حضور و غیاب یک باند مشخص میشود. نشانگرهای RAPD از نوع غالب هستند. از مزایای این روش امکان بررسی همزمان چندین جایگاه در ژنوم نمونهها و عدم نیاز به مواد رادیواکتیو میباشد. از معایب این روش میتوان به تکرارپذیری کم، غالبیت و عدم امکان تشخیص سیستم آللی اشاره کرد. از این روش جهت شناسایی ارقام و ردهبندی درون گونهای و بین گونهای در گیاهان مختلف استفاده کرد. نشانگر RAPD در روش تجزیه تودهای افراد درحال تفرق بهترین گزینه است.
نشانگرهای اختصاصی
AFLP
با روش AFLP نشانگرهایی تولید شد که علاوه بر دارا بودن مزایای RFLP مانند دقت و تکرارپذیری، دارای ویژگیهای مثبت روشهای مبتنی بر PCR نیز میباشند (وس و همکاران 1995). این روش براساس تکثیر انتخابی برخی قطعات از بین تمام قطعات هضم شده DNA میباشند. این روش شامل سه مرحله مجزا میباشد. در مرحله اول DNA موردنظر را با یک آنزیم محدودگر هضم کرده و سپس اتصال آنها به آداپتور ایگونوکلئوتیدی.در روش AFLP استاندارد معمولاً از ترکیب آنزیمی MseI / EcoRI در واکنش هضم استفاده می‌گردد. در مرحله دوم طراحی و ساخت آغازگر و همچنین تکثیر انتخابی دستهای از قطعات حاصل از هضم انجام میشود. در مرحله سوم جداسازی قطعات حاصل از تکثیر بر روی ژلهای پلی آکریل آمید و سپس رنگآمیزی با نیترات نقره برای ثبت نتایج انجام میشود. هریک از قطعاتی که به صورت باند بر روی ژل ظاهر میشود میتوانند به عنوان یک نشانگر ژنتیک مورد استفاده قرار بگیرد. در این روش در مقایسه با سایر روشها بیشترین تعداد نشانگر به ازای هر ژل به دست میآید. همچنین دقت و تکرارپذیری این روش بسیار بالا است ولی از معایب عمده این روش میتوان به غالب بودن این نشانگر و عدم امکان تشخیص آللهای هر نشانگر اشاره کرد[82].
SSR
SSR یکی از مهمترین گروههای نشانگرهای مولکولی میباشد. این روش مبتنی بر PCR میباشد و در انگشت نگاری DNA، نقشه یابی ژنتیکی، MAS و مطالعه تنوع ژنتیکی و ژنتیک جمعیت استفاده میشود. این دسته از نشانگرها در موجودات پیشرفته تر مثل هسته داران دیده میشود. این گروه از نشانگرها مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز هستند که دارای موتیف تکرار شونده به طول یک تا شش جفت باز میباشند و میتوانند تا حدود 100 برابر تکرار شوند. این توالیها عمدتا در مناطق بین ژنی و مناطق غیر رمز کننده در سراسر ژنوم توزیع شدهاند. نشانگرهای میکروساتلایتی فراوان، پلیمورفیسم زیاد و همبارز هستند. در این نشانگر، فرآوردههای PCR را میتوان با استفاده از ژل آگارز، ژل پلی آکریل آمید غیر واسرشته کننده و ژل پلی آکریل آمید واسرشته کننده آشکار نمود. از سیستم ژل آگارز با استفاده از غلظت بالای 2 درصد و سپس رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید معمولا در برنامه MAS استفاده میکنند. ولی در بقیه موارد از ژل پلی آکریل آمید و از الکتروفورز عمودی استفاده میکنند. ردیف های تکرار شونده بر اساس اندازه واحد تکرار به چهار گروه تقسیم میشوند [82].
DNA ماهواره ای:
در ماهواره ها ردیف های تکرار شونده از چند جفت باز تا چند صد جفت باز تکرار میشوند. ماهواره ها معمولا در نواحی هتروکروماتین قرار دارند. ماهواره ها معمولا رونوشت برداری نمیشوند و فعالیت خاصی ندارند، ولی تصور میشود که در جفت شدن، تفرق یا نوترکیبی کروموزوم ها نقش دارند. محققین از ماهواره ها برای نقشه یابی ژنوم انسان به عنوان نشانگرهایی که با سانترومر ارتباط دارند استفاده میکنند.
ماهوارک ها:
ماهوارک ها واحدهای 10 تا 60 جفت بازی هستند که ممکن است صدها بار تکرار شده باشند. ماهوارک ها بیشتر در نواحی یوکروماتین ژنوم پستانداران، قارچ ها و گیاهان قرار دارند. از ماهوارک ها در انگشت نگاری DNA انسان استفاده میکنند.
میان ماهوارهها:
این اصطلاح، برای بیان دستهای از DNAهای تکراری که ویژگیهای ماهوارکها و ریزماهوارهها را دارند و طول آنها در جایگاه مربوطه در حدود 40 جفت باز میباشد.
ریز ماهواره ها:
شامل واحدهای تکی، دوتایی، سه تایی، چهارتایی، پنج تایی، یا شش تایی تکرار شونده هستند که در ژنوم یوکاریوت ها پراکنده هستند.
مزیتهای SSR به شرح زیر میباشد: