معرفی تکنیک و مورفولوژی

دانلود پایان نامه

334/0-r=
001/0*
106/0-r=
0001/0*
*: معنی دار در سطح 05/0 (P value=0.05)
r: ضریب همبستگی
3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم
یک رابطه مستقیم (مثبت) بین میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و میزان آپوپتوز نمونه ها دیده شد.
3-10- نتایج کلی
1- پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up میزان قابلیت حیات اسپرم به 100 درصد رسید.
2- در همه نمونه های مورد مطالعه پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up میزان تحرک و مورفولوژی افزایش و درصد اسپرم های بی تحرک کاهش معنی داری را نشان دادند.
3- بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up درصد قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به طور معنا داری کاهش داشت.
4- بعد از انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد در زمان های مختلف(3،2،1،0) مشاهده شد که پس از گذشت دوساعت میزان قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم به طور معناداری افزایش نشان داد، که مشخص می کند بهترین زمان برای انکوباسیون اسپرم در دمای 37درجه سانتی گراد زمان کمتر از دو ساعت برای نمونه های اسپرم نرمال می باشد.
فصل چهارم
بحث
4-1- تاثیر روش آماده سازی Direcct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم
در این تحقیق همانطور که انتظار می رفت میزان تحرک اسپرم و اسپرم ها با مورفولوژی سالم و همچنین اسپرم های زنده نسبت به قبل از شستشوی اسپرم به روش Direct swim up افزایش چشمگیری داشتند و نیز میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و آپوپتوز به طور معنی داری نسبت به قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct swim up کاهش نشان داد .
محققین دیگری نیز به نتایج مشابه ی در مورد بهبود پارامترهای اسپرم در روش Swim up دست یافتند، به طوری که اسپرم های جمع آوری شده، هم از نظر تعداد و هم از نظر مورفولوژ ی طبیعی از میزان بیشتری نسبت به رو ش های د یگر برخوردار بود(Michaeli, Peer, Anderman, Ballas, & Ellenbogen, 2004). بعضی از محققین با مقایسه دو روش Swim up و Percoll Gradient به این نتیجه رسیدند که اگرچه تعداد اسپرم در روش Percoll به صورت معنی داری بیشتر از روش Swim up است ولی درصد حرکت پیشرونده در روش Swim up بیشتر است . همچنین این روش بر ای افزایش قابلیت باروری در سیکل های درمانی و حذف اسپرم هایی که از بلوغ کمتری برخوردار بوده و یا در مرحله آناپلوئیدی به سر می برند؛ مناسب می باشد (Jakab, et al., 2003). علی رغم این که روش های مختلفی برای جداسازی اسپرم وجود دارد؛ اما بسیاری همچنان بر روش شستشو و Swim up مایع سیمن تاکید داشته و آن را برای دستیابی به اسپر م های با حرکت بیشتر و پیشرونده، مناسب می دانند(Paasch, Grunewald, & Glander, 2007). یکی دیگر از پارامترها ی اصلی اسپرم ، میزان مورفولوژ ی طبیعی آن است که نقش تعیین کنند ه ای در باروری افراد دارد . لذا اگر طی انجام روشی، بتوان میزان بیشتری از اسپر م های طبیعی را جمع آوری نمود ؛ مسلما میزان باروری نیز افزایش خواهد یافت. Scott به مقایسه تاثیر یک بار و دوبار شستشو در روش Swim up بر مورفولوژی سر اسپرم پرداخت و به این نتیجه دست یافت که دو بار شستشو در روش Swim up باعث می گردد تا اسپرم هایی که دارای شکل طبیعی و دار ای واکنش آکروزومال بهتر ی هستند ؛ جدا شوند و یا اسپرم هایی جدا شوند که از توانایی بیشتری در مقابل محیط هیپواسماتیک برخوردارند (Esteves, Sharma, Thomas Jr, & Agarwal, 2000).. عده ای نیز بر این باورند که در روش Swim up میزان قطعه قطعه شدن DNA نیز به صورت معنی داری کاهش می یابد(Younglai, Holt, Brown, Jurisicova, & Casper, 2001). نتیجه این تحقیق موید آن است که کاهش میزان میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم می تواند باعث افزایش لقاح و تشکیل جنین در روش های کمک باروری (ART) و همچنین افزایش میزان حاملگی و تولد نوزاد زنده شود. بعضی از مطالعات نشان می دهد که اگرچه روش Swim up شاید کمک چندانی به نمونه های طبیعی ننماید و حتی ممکن است در این خصوص روش هایی مثل Percoll Gradient بهتر از آن عمل نماید ولی این روش در نمونه های اولیگواسپرمی، آستنواسپرمی و تراتواسپرمی کاملاً تاثیر خود را نشان داده و باعث می گردد تا اسپرم های طبیعی بیشتری جدا شوند و درمان ناباروری از نتا یج بهتر ی برخوردار باشد(Adiga & Kumar, 2001). به همین دلیل، بعضی از محققین انجام Swim up double washing را پیشنهاد داده و معتقدند که این روش مخصوصاً برای انجام IVF که اسپرم ها باید در اطراف اووسیت قرار گرفته و در محیط انکوباتور، لقاح انجام پذیرد ؛ بسیار مناسب بوده و نتایج بهتری را دنبال خواهد داشت (Chen, et al., 1995). همین ایده در روش آماده سازی اسپرم بر ای انجام IUI نیز وجود داشته و بس یار موثر بوده؛ منتها روش Swim up تک مرحله ای آسان تر و کم هزینه تر بوده است(Inaudi, Petrilli, Joghtapour, Trusso, & Petraglia, 2002).
برخی دیگر بر این باورند که swim up باعث می گردد تا تعداد و حرکت اسپرم ها در افرادی که نرموآزواسپرمی و یا آستنوتترازوسپرمی هستند، افزایش یابد(Purvis & Egdetveit, 1993) و یا اینکه با حذف اسپرم هایی که از بلوغ کمتری بر خوردار ند(Scott, Oehninger, Menkveld, Veeck, & Acosta, 1989) و همچنین کاهش میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم(Younglai, et al., 2001) و جدا شدن اسپرم هایی که با سر بیضی شکل خود دارای ناحیه آکروزومی بزرگتری هستند (Dominguez, Burgos, & Fornes, 1999)، لقاح نیز افزایش یافته و به ازای هر سیکل ممکن است تا 10 درصد حاملگی نیز افزایش نشان دهد. پس می توان به این نتیجه رسید که روش Direct swim up یک روش مناسب برای آماده سازی نمونه های سیمن برای استفاده در تکنیک های کمک باروری مخصوصا برای استفاده در روش IUI به این دلیل که در این روش معمولا از نمنوه های نرمال استفاده شده و روش Direct swim up بسیار مناسب برای نمونه های نرمال است .
4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم
انکوباسیون اسپرم آماده شده و شسته شده در دمای 37 درجه سانتی گراد برای استفاده در تکنیک های کمک باروری (ART) امری واجب و معمول است که در مراکز ناباروری صورت می گیرد. بررسی تاثیر انکوباسیون آزمایشگاهی اسپرم از تحقیقات و پژوهش هایی است که مورد توجه محققین در دهه ی اخیر قرار گرفته است. تحقیقات اولیه در مورد اثر انکوباسیون اسپرم بر روی پارامترهای اسپرم نظیر تحرک، قابلیت حیات و مورفولوژی بوده است. با مشخص شدن نقش مهم سلامت و کیفیت DNA اسپرم در باروری و موفقیت تکنیک های کمک باروری و همچنین معرفی تکنیک های جدید برای ارزیابی وضعیت و سلامت DNA اسپرم مثل بررسی آپوپتوز اسپرم به وسیله ی تکنیک TUNEL، بررسی ساختار کروماتین اسپرم توسط روش SCSA، مشخص کردن قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به وسیله تست SCD و روش comet می توان اشاره کرد.بسیاری از گروه های تحقیقاتی تلاش های زیادی برای پیدا کردن ارتباط بین انکوباسیون کوتاه مدت و طولانی مدت سلول های اسپرم با یکپارچگی DNA اسپرم انجام داده اند(Calamera, et al., 2001; Matsuura, Takeuchi, & Yoshida, 2010; Muratori, et al., 2003; Zhang, et al., 2011). ما در این مطالعه آینده نگر سعی داشتیم اثر زمان های مختلف بر روی میزان قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز سلول های اسپرم نرمال آماده شده به روش Direct swim-up در اثر انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد را پیدا کنیم، که بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم را با استفاده از تست SCD و بررسی میزان آپوپتوز اسپرم به وسیله تکنیک TUNEL صورت گرفت.
نتیجه ای که ما در این مطالعه به دست آوردیم نشان داد که بعد از گذشت دو ساعت انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و آپوپتوز به میزان قابل توجهی افزایش پیدا می کند. به تازگی Matsuura وهمکاران در سال 2010 اثر انکوباسیون اسپرم در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد بدون CO2 و دارای CO2 را بر روی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم بررسی کردند. آنها دریافتند که پس از گذشت 3 ساعت و 24 ساعت میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم در انکوباتور CO2 دار نسبت به بدون CO2 به صورت معنی داری بالا بوده و همچنین میزان قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد نسبت به دمای اتاق به صورت معنی داری بالا بوده است. آن ها از روش SCSA برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA استفاده کردند (Matsuura, et al., 2010). Dalzell و همکاران در سال 2004 نشان دادند که DNA اسپرم حاصل از عمل TESE بعد از گذشت 4 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد دچار آسیب می شود. (Dalzell, McVicar, McClure, Lutton, & Lewis, 2004).
Hammadeh و همکاران در سال 2001 نشان دادند که انکوباسین اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بازشدگی و خارج شدن از حالت فشرده هسته اسپرم هنگام لقاح با تخمک را کاهش می دهد. آن ها مشاهده کردند که بعد از دو ساعت انکوباسیون میزان عدم خروج هسته ی اسپرم از حالت فشرده از 25 درصد به 88 درصد افزایش پیدا می کند(Hammadeh, Strehler, Zeginiadou, Rosenbaum, & Schmidt, 2001).
در یک مطالعه انجام شده توسط Fernandez وهمکاران در سال 2007 در مورد پویایی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم اسب نر بوده است نشان دادندکه بیشترین میزان آسیب که به DNA اسپرم وارد شده زمان های بیش از 6 ساعت انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد می باشد. در این تحقیق از تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم استفاده شده بود. همچنین اثر مضر دیگری که انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد روی اسپرم می گذارد تغییرات مورفولوژیکی سر اسپرم است که میزان باروری اسپرم را تحت تاثیر قرار می دهد و باعث کاهش میزان باروری اسپرم می شود(López-Fernández, et al., 2007). Peer و همکاران نشان دادند که میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و آپوپتوز اسپرم های دارای واکوئل بعد از دو ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد نسبت به دمای 21 درجه سانتی گراد به میزان معنی داری افزایش پیدا می کند(Peer, et al., 2007).