مورفولوژی و استاندارد

دانلود پایان نامه

1-12-1-5- تکنیک SCSA
اساس این روش وجود حساسیت ساختار کروماتین و DNA هنگام مواجه با اسید و ویژگیهای متا کروماتیک آکریدین اورانژ است. این فلوروکروم به عنوان یک منومر بین دو زنجیره DNA قرار میگیرد و زمانی که DNA طبیعی است رنگ سبز و زمانی که فلوروکروم با تک رشتهای DNA ترکیب شود، رنگ قرمز-نارنجی از خود ساطع میکند. اسپرمهای رنگ گرفته توسط فلوسایتومتری مشخص میشوند. محققان در مطالعات بالینی بیشتر از این روش استفاده میکنند، با به کارگیری این روش میتوان میزان موفقیت باروری را در افراد مشخص کرد(Evenson, Larson, & Jost, 2002).
1-12-1-6- تست SCD
یکی دیگر از روشهایی که اخیراً جهت بررسی آسیب DNA اسپرم به کار گرفته شده است، روش پراکندگی کروماتین اسپرم است که اساس آن شبیه تکنیک SCSA و بر اساس مستعد بودن شکستیهای DNA جهت تخریب در هنگام مواجه با اسید است. وجود آسیب در DNA اسپرم با استفاده از وجود هالههای کروماتین خارج شده از تراکم در اطراف هسته اسپرم تشخیص داده میشود. از مزایای این روش، آسان، مقرون به صرفه و حساس بودن است. هر چند نتایج کلینیکی این تکنیک مورد بررسی قرار نگرفته ولی به نظر میرسد که میتوان از آن به صورت معمول در آزمایشگاههای آندرولوژی استفاده کرد(Fernandez, et al., 2003).
شکل1-3- تست SCD
1-12-1-7- رنگآمیزی آکریدین اورانژ
استفاده از رنگ متا کروم آکریدین اورانژ یکی دیگر از روشهای بررسی آسیب DNA اسپرم است. اساس این تکنیک مانند SCSA است. مشکل اساسی این تکنیک متغیر بودن مشاهدهگر برای تشخیص رنگ فلورسنت بین سبز و نارنجی است که احتمالاً یک سری رنگهای حد واسط با یک حساسیت متفاوت برای دناتوره شدن اسپرم وجود دارد(Nasr-Esfahani, Razavi, & Mardani, 2001) .
1-12-1-8- رنگآمیزی تولوئیدین بلو
تولوئیدین بلو یک رنگ متا کروم مرتبط با هسته اسپرم و کروماتین آن است. این رنگ پس از اتصال به کروماتین غنی از هیستون سرشار از لیزین، بنفش پررنگ میشود. در صورتی که اگر به کروماتین غنی از پروتامین اتصال یابد آبی کمرنگ میگردد. این رنگآمیزی جهت بررسی میزان بلوغ هسته و تراکم کروماتین به کار میرود. این تست ساده، کم هزینه و با میکروسکوپهای معمولی قابل اجراست(Krzanowska, 1982) .
1-13- روش مهاجرت اسپرم
این روش قدیمیترین روش جداسازی اسپرم است که به طور معمول مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک اولیهی که توسط ماهادوان و بیکر(Mahadevan & Baker, 1984) در سال 1984 شرح داده شد، هنوز هم به طور گستردهای در آزمایشگاههای IVF کاربرد دارد. استفاده از این تکنیک در بیمارانی با پارامترهای اسپرمی نامناسب محدودیت دارد، اما برای افرادی با اسپرم طبیعی، روش استاندارد و قابل اعتمادی است(Henkel & Schill, 2003). اساس روش Swim up بر پایه حرکت فعال و پیشرونده اسپرم از رسوب اسپرم به قسمت فوقانی محیط شستشو است. در این روش بیشتر از 90 درصد اسپرمهای جدا شده حرکت داشته و از لحاظ مورفولوژی، طبیعیتر از نمونه قبل از شستشو است. همچنین در میان اسپرمهای جدا شده، سلولهای دیگر مانند سلولهای زاینده و گلبولهای سفید وجود ندارد. بازده این روش، وابسته به حرکت اسپرمها در مایع منی است(Henkel & Schill, 2003) ولی نتیجه به دست آمده به تعداد آزمایشگاهها متفاوت است، چرا که در نتیجه این روش ، عواملی مانند دفعات سانتریفیوژ، نوع محیط کشت مورد استفاده، زمان انکوباسیون و . . . دخالت دارد.
1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت
در این روش، جداسازی اسپرمها بر اساس جرم حجمی آنها در هنگام سانتریفیوژ صورت میگیرد. ابتدا 2 لایه مجزا از هم با غلظت متفاوت از ماده جدا کننده (Gradient) را در لولههای مخصوص تهیه کرده و سپس منی مایع شده بر لایههای Gradient قرار میگیرد. این لایههای گرادیانت از دانههای سیلیس پوشیده شده با PVP یا مولکولهای دیگر با نامهای تجاری متفاوت مانند پرکول، پیور اسپرم، و … تهیه میشود. با انجام سانتریفیوژ اسپرمهای زنده که دارای جرم حجمی بیشتری هستند (نسبت به اسپرم مرده) با سرعت بیشتری به طرف انتهای لوله حرکت میکنند. در صورتی که سلولهایی مانند سلولهای زاینده، گلبولهای سفید و باکتری که جرم حجمی کمتری دارند، آهستهتر حرکت کرده و ما بین لایههای فوقانی قرار میگیرند. با رعایت سرعت و دور چرخش سانتریفیوژ، میتوان به راحتی اسپرمهای زنده، دارای جرم حجمی بالا و اسپرمهای بالغ را از اسپرمهای مرده و یا دیگر سلولها جداسازی کرد. خلوص شیمیایی و کیفیت لایههای به کار رفته در این روش میتواند بر ساختار اسپرم تأثیر مثبت یا منفی بگذارد(Henkel & Schill2003).
فصل دوم
مواد و روش ها
2-1-مواد و وسایل مورد نیاز
2-1-1-وسایل مورد نیاز
1-هود بهداد، ایران
2-هود کلاس دو Luminar Flow
3-انکوباتور(CO2 5%، 37 درجه سانتی گراد، رطوبت 95%) Memmert، آلمان
4-انکوباتور (37 درجه سانتی گراد) بهداد، ایران
5-میکروسکوپ نوری Olympus، ژاپن
6-ترازو با دقت0001/0 گرم Scaltec، سوئد
7-MAKLER COUNTING CHAMBER