مورفولوژی و استاندارد

دانلود پایان نامه

2-10میکرولیتر نمونه با سمپلر برداشته و درون میکروتیوپ حاوی رنگ ریخته می شود و با عمل پیپتینگ با ائوزین-نیگروزین مخلوط می شود و 30 ثانیه وقت داده می شود.
3- سپس 10 میکرولیتر از آن را با سمپلر برداشته روی لام گذاشته می شود و به وسیله ی لام دیگری از این اسمیر تهیه می شود تا خشک شود.
4- بعد توسط میکروسکوپ نوری مشاهده می شود، بهتر است با بزرگنمایی X 100 بررسی شود. اسپرم هایی که رنگ را به خود گرفته اند و قرمز یا صورتی شده اند مرده و آنهایی که سر سفید دارند و رنگ را به خود نگرفته اند زنده اند.
B
تعداد100 اسپرم شمرده می شود. نتایج در قبل و بعد از شستشو به روش Direct swim up ثبت گردید(WHO 2010).
A
2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی
طبق استاندارد WHO ، اگر در نمونه انزالی 30% یا بیشتر از اسپرم ها مورفولوژی طبیعی داشته باشند نمونه در محدوده ی طبیعی قرار داده می شود. برای تعیین مورفولوژی اسپرم از روش رنگ آمیزی پاپانیکولا طبق دستور WHO انجام شد.باید 100 اسپرم با بزرگنمایی 100 بعد از رنگ آمیزی مطالعه کرد تا بتوان انواع طبیعی را از انواع غیر طبیعی مشخص نمود، تا درصد مورفولوژی نمونه گزارش شود. طیف اشکال غیر طبیعی اسپرم بسیار وسیع است. اشکال غیر طبیعی اسپرم عبارتنداز: اسپرم های دارای دوسر، سر بزرگ، سر کوچک، سر گرد و بدون آکروزوم، سر سنجاقی، اسپرم ها یی با دم های غیر طبیعی بلند یا کوتاه، دو دم، بدون دم، دم پیچ خورده یا زوائد سیتوپلاسمی در ناحیه قطعه میانی وگردن است.
2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا
این نوع رنگ آمیزی رنگ آمیزی خوبی برای اسپرم ودیگر سلول ها می باشد. باعث رنگ شدن آکروزوم و بعد از آکروزوم ، قسمت سر و قطعه میانی می شود که سر رنگ آبی و قطعه میانی به رنگ قرمز یا صورتی در می آید. جهت بررسی مورفولوژی نمونه، ابتدا از هر نمونه یک لام فیکس می شود تا بعداً به طور یک جا رنگ آمیزی پاپانیکولا روی آنها انجام می شود. برای هر نمونه یک لام قبل از عمل Swim-up و یک لام بلافاصله بعد از عمل Direct Swim-upبه صورت فیکس شده از اسپرم تهیه شد.
2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن
1-10 میکرولیتر از سیمن را توسط سمپلر برداشته و روی لام قرار داده می شود.
2-به وسیله ی لام دیگری از آن اسمیر تهیه می شود و اجازه داده می شود در محیط خشک شود. از لام هایی که در کناره دارای برچسب هستند استفاده می شود تا بتوان لام ها را با مداد شماره گذاری کرد، به عنوان مثال نحوه ی شماره گذاری لام ها به این صورت بود: b1(نمونه شماره یک قبل ازDirect Swim-up ) و a1 (نمونه شماره یک پس ازDirect Swim-up).
3- لام ها را درون بسکت قرار داده می شود و درون جار حاوی اتانول- اتر(ترکیب مساوی از اتر واتانول 96%) به مدت 4 دقیقه قرار داده می شود.
4- بسکت حاوی لام ها از جار خارج کرده و در دمای محیط گذاشته می شود تا خشک شود.
5-سپس لام ها را در جعبه لام قرار داده و تا زمان رنگ آمیزی در فریزر نگهداری می شود.
2-3-2-2-5-3- روش رنگ آمیزی پاپانیکولا
لام های فیکس شده که در فریزر بودند را بیرون آورده، 19 جار برداشته ودرون آن محلول مورد نظر را ریخته ولام ها را درون بسکت قرار داده و در زمان های مشخص شده طبق دستور العملWHO در جار ها قرار داده می شود.
جدول2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا
ماده
زمان مورد نیاز
1-اتانول 80%
30 ثانیه
2-اتانول 50%