مورفولوژی و استاندارد

دانلود پایان نامه

3- سپس 3/2 مایع رویی که حاوی اسپرم های متحرک با مورفولوژی خوب هست جدا شده و داخل یک لوله آزمایش ریخته می شود.
4- 5/1 تا 2 سی سی محیط کشت اسپرم به تست تیوپ اضافه می شود و به مدت 5 دقیقه با دور 500-300g سانتریفوژ می شود.
5-بعد از سانتیریفیوژ 5/0 میلی لیتر محیط کشت اسپرم ته لوله روی رسوب تشکیل شده باقی گذاشته و سپس رسوب درون محیط کشت اسپرم باقی مانده حل می شود(WHO 2010).
2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)
یکی از روش های بررسی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با این روش می باشد که باید بر روی نمونه تازه صورت گیرد.
1-3-4-1- روش کار
1-ابتدا آگارز استاندارد با غلظت 65/0درصد آماده می شود سپس آگارز را در مایکروفر گذاشته تا آگارز ذوب شده و شفاف گردد، بعد یک لام لیبل دار برداشته و داخل آگارز ذوب شده می شود و بیرون کشیده می شود تا یک لایه آگارز روی لام قرار گیرد سپس پشت لام با دستمال از آگارز تمیز می شود همچنین می شود با استفاده از سمپلر آبی آگارز برداشته شود و بر روی تمام نقاط لام ریخته می شود، ضخامت آگارز روی لام باید کم باشد، بعد در دمای محیط گذاشته می شود تا آگارز روی لام ببندد.
2- آگارز با نقطه ذوب پایین با غلظت 1 درصد ساخته می شود سپس در مایکروفر گذاشته تا آگارز با نقطه ذوب پایین ذوب شده و شفاف گردد.
3- با سمپلر 70 میکرو لیتر آگارز با نقطه ذوب پایین برداشته ودرون یک میکروتیوپ ریخته می شود، بعد با سمپلر 30 میکرو لیتر نمونه را برداشته و داخل میکروتیوپ ریخته می شود سپس آگارز با نقطه ذوب پایین با نمونه مخلوط کرده؛ بعد 50 میکرولیتر از این مخلوط را با سمپلر روی لامی که آگارز معمولی بود ریخته می شود و بعد برروی آن یک لام بزرگ mm)50×24) قرار داده می شود و به مدت 4 دقیقه در یخچال نگه داری می شود تا ببندد.
4- سپس لامل به صورت موازی با سطح لام کشیده می شود تا لامل از لام جدا شود.
5- بعد لام درون محلول HCl 08/0 نرمال به مدت 17 دقیقه در تاریکی قرار داده می شود.
6- لام به مدت 10 دقیقه در محلول شماره یک در دمای اتاق قرار داده می شود، محلول شماره یک چون داری مرکاپتواتانول می باشد در زیرهود این کار را انجام می شود.
7- لام به مدت 15 دقیقه در محلول شماره دو در دمای اتاق قرار داده می شود.
8- سپس لام را به مدت 2 دقیقه در محلول شماره سه در دمای اتاق قرار داده می شود.
9- بعد لام در سری های الکل 70 درصد،90 درصد و100 درصد هر کدام به مدت 2 دقیقه قرار داده می شود. این کار برای آبگیری از نمونه ها لازم می باشد. استفاده از سری های الکل برای آبگیری به این دلیل است که فرایند آبگیری آهسته انجام شود و سلول به یکباره آسیب نبیند.سپس لام در دمای اتاق گذاشته می شود تا خشک شود.
10- در داخل یک لوله رنگ رایت با محلولPBS به نسبت یک به یک مخلوط می شود، سپس این مخلوط با سمپلر بر روی تمام لام ریخته می شود و به مدت 10 دقیقه زمان داده می شود.
11- لام در آب روان قرار داده می شود تا زمانی که آب شفاف شده و اثری از رنگ رایت در آب دیده نشود.
12- لام در مجاورت هوا قرار داده می شود تا خشک شود.
13-حال لام برای آنالیز از نظر قطعه قطعه شدن DNA آماده شده است، لام آماده شده با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X100 بررسی می شود و تعداد 100 اسپرم شمارش می شود و میزا ن سلول هایی که دچار قطعه قطعه شدن DNA شدند به صورت درصد بیان می شود، قطعه قطعه شدن DNA بر اساس تشکیل هاله در اطراف سر اسپرم به 4 حالت می باشد که عبارتنداز(Fernandez, et al., 2003):
1-هسته اسپرم با هاله بزرگ ( بدون قطعه قطعه شدن DNA)
2-هسته اسپرم با هاله متوسط( بدون قطعه قطعه شدن DNA)
3-هسته اسپرم با هاله کوچک( دارای قطعه قطعه شدن DNA)
4-هسته اسپرم بدون هاله(دارای قطعه قطعه شدن DNA)
2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل