مورفولوژی و جابه جایی

دانلود پایان نامه

قطعه قطعه شدن DNA با واسطه فعالیت اندونوکلئازهای درون سلولی وابسته به کلسیم ومنیزیم اتفاق می افتد. این آنزیم ها، DNA را در مناطقی که بین نوکلئوزوم ها قرار گرفته است می شکافند وقطعات یکسان DNA ایجاد می کنند. تراکم کروماتین: یکی از تغییرات زود هنگام در آپوپتوز متراکم شدن کروماتین در زیر غشای داخلی هسته می باشد. این فرایند می تواند با یک فلورو کروم پلی نوکلوئید خاص مانند “پرو پیدیوم یدید و یا DAPI” آشکار شود(Bowen, 1993).
قطعه قطعه شدن هسته: اتفاق دیگر آپوپتوز، متراکم شدن هسته است. این همان قطعه قطعه شدن هسته در مراحل کلیواژ، مورولا و یا بلاستوسیست است که کوچکتر از هسته های سالمند(Bowen, 1993).
قطعه قطعه شدن سیتوپلاسم: درصد بسیاری از جنینهایی که به صورت in vitro رشد می کنند، درجات مختلفی از قطعه قطعه شدن سیتوپلاسم در آن ها دیده می شود. این قطعات شبیه به اجسام آپوپتوتیک می باشند که در آن ها اندامک های سلولی مشاهده شده است. ظهور این قطعات همراه با افزایش اختلال کروموزومی بوده و پیش زمینه ای برای شروع آپوپتوز می باشد(Erenpreiss, et al., 2004).
1-6-2-4- روش های بررسی آپوپتوز
جهت سنجش آپوپتوز و بررسی مکانیسم آن روش های متعددی بر مبنای تغییرات مورفولوژیک و بیو شیمیایی سلول های آپوپتوزی طراحی ومعرفی شده اند. مهمترین نکته ای که می بایست در نظر گرفته شود انتخاب درست تکنیک سنجش آپوپتوز بر مبنای نوع مطالعه (روی سلول یا بافت)، القاءکننده مورد نظر، مکانیسم مورد بررسی و سازگاری حساسیت و اختصاصی بودن نتایج بر مبنای تعداد سلول یا غلظت آنالیت مورد سنجش است. پدیده های بیو شیمیایی که در همه و یا اغلب سلول های آپوپتوزی رخ می دهد به تشخیص بهتر و واضح تر این پدیده در سلول ها کمک می کند. روش انتخابی جهت بررسی آپوپتوز به نوع سلول مورد نظر و هدف تحقیق بستگی دارد. برخی از این روش ها جهت نمونه کوچک مناسب بوده در حالی که برخی دیگر جهت آزمایشات گسترده با نمونه بزرگ به کار می رود(Bröker, Kruyt, & Giaccone, 2005).
1-6-2-4-1- بررسی تغییرات غشاء پلاسمایی در مرگ سول
فسفاتیدیل سرین، فسفو لیپدی است که به طور نرمال در سطح داخلی غشاء پلاسمایی قرار گرفته است. یکی از اولین وقایع در طی آپوپتوز خروج فسفاتیدیل سرین وقرار گرفتن آن در سطح سلول است.
این مسئله از دوجهت مهم می باشد: اول اینکه این تغییر معمولا مقدم بر سایر تغییرات مورفولوژی مانند تراکم کروماتین، قطعه قطعه شدن DNA و بر آمدگی غشاء و تشکیل اجسام آپوپتوزی می باشد. دوم اینکه فسفاتیدیل سرین یکی از مولکول های سطح سلول آپوپتوزی است که توسط ماکروفاژها شناسایی می شود و بنابراین نقش کلیدی در حذف سلول های مرده قبل از پاره شدن غشاء ان ها و بروز واکنش التهابی و تخریب بافتی دارد. دومین تغییر غشایی از دست دادن یکنواختی غشاء می باشد که در نکروز در مراحل اول مشاهده می شود در حالی که در آپوپتوز از جمله وقایع ثانویه می باشد(Heemels, Dhand, & Allen, 2000).
1-6-2-4-1-1- تعیین فسفاتیدیل سرین سطح بیرونی غشاء سلول
با استفاده از یک پروتئین متصل شونده به فسفاتیدیل سرین این کار صورت می گیرد، که همان
آنکسین V است. در این حالت آنکسین V فقط به فسفاتیدیل سرین موجود در لایه خارجی غشاء متصل می گردد. این روش سریع وساده بوده و سلول ها می توانند فیکس شوند(Hashemi, Karami-Tehrani, & Farzami, 2003).
1-6-2-4-2- بررسی سیتوتوکسیسیتی
بررسی سیتوتوکسیسیتی اولین گام در بررسی آپوپتوز است. با این روش میزان مرگ سلولی مورد ارزیابی قرار می گیرد. این روش قادر به تمایز آپوپتوز از نکروز نیست. با بررسی سیتوتوکسیستیی درصد سلول های زنده یا مرده نسبت به گروه شاهد به دست می آید. دو روش متداول بررسی سیتوتوکسیستی، روش MTT و رنگ آمیزی تریپان بلو است.
1-6-2-4-3- بررسی تغییرات مورفولوژی
تغییرات مورفولوژی در آپوپتوز عبارتنداز : چروک شدن سلول، تراکم کروماتین، قطعه شدن هسته و تشکیل اجسام آپپتوتیک(Sun, Jurisicova, & Casper, 1997). در طی این تغییرات، میتوکندری بخوبی حفظ شده در حالی که در هسته تراکم کروماتین و قطعه قطعه شدن DNA رخ می دهد. سلول ها چروکیده شده، از سلول های مجاور جدا شده و غشاء سلول برآمده می شود و به صورت اجسام آپوپتوزی جدا شده و غشاء سلول برآمده می شود و به صورت اجسام آپوپتوزی جدا می شود که از لحاظ اندازه و ساختمان با یکدیگر متفاوتند.
1-6-2-4-3-1- استفاده از میکروسکوپ الکترونی
در بررسی مورفولوژی هسته ی سلول های آپوپتوزی توسط میکروسکوپ الکترونی، هسته ی قطعه قطعه شده و کروماتین متراکم در کنار آن دیده می شود. سیتوپلاسم متراکم دارای برآمدگی حباب مانند شده و حباب های متفاوتی با اندازه و محتویات متفاوت تشکیل می شوند که برخی از آن ها حاوی قطعه های هسته نیز می باشند. علی رغم تغییرات هسته ای، ارگانل های سیتوپلاسمی در طی مرگ آپوپتوزی به خوبی حفظ شده در حالی که در نکروز هیچ تغییری در کروماتین و هسته مشاهده نشده بلکه سلول متورم شده و غشاء پلاسمایی از هم گسیخته و محتویات سلولی به بیرون می ریزد. این روش وقت گیر و پر هزینه می باشد.
1-6-2-4-3-2- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس
با میکروسکوپ نوری می توان تراکم کروماتین و اجسام آپپتوتیک در سلول های رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین ائوزین(H&E) را مشاهده کرد. میکروسکوپ نوری توانایی کمی برای شناسایی سلول های آپپتوتیک دارد، ولی اگر هسته با پروپیدیوم یدید رنگ آمیزی شود می توان آپوپتوز را از نکروز تمایز داد. میکروسکوپ فلورسانس دقت بیشتری دارد. از رنگ های هسته ای فلورسانس از قبیل هوخست-33258 و DAPI می توان برای تغییرات هسته ای استغاده کرد. این رنگ ها به دلیل خاصیت فلورسانس، در مطالعات میکروسکوپ فلورسنت جهت تشخیص مورفولوژی هسته سلول های آپوپتوزی استفاده می شود. اساس این روش تغییرات اولیه هسته و مشاهده اجسام آپوپتوزی می باشد. باید توجه داشت قبل از رنگ آمیزی، سلول های به هم چسبیده از سلول های مجاورشان جدا شوند(Huerta, Goulet, Huerta-Yepez, & Livingston, 2007).
1-7- منشاء آسیب DNA اسپرم
دلایل ایجاد آسیب در DNA اسپرم مانند دلایل ایجاد ناباروری در مردان پیچیده و وابسته به فاکتورهایی از جمله عوامل درون بیضه ای یا خارج از بیضه ای است . اگرچه آسیب DNA اسپرم درمردان نابارور شناسایی و به نقص در مرحله اسپرماتوژنز مربوط است، ولی اسپرم افراد بارور نیز با میز ان قابل تشخیصی از آسیب DNA همراه است(Ozmen, Koutlaki, Youssry, Diedrich, & Al-Hasani, 2007).
اسپرماتوژنز شامل تکثیر سلول های جنسی مذکر (germ cell)، تقسیم میوز و تمایز اسپرماتید به اسپرماتوزوا است. بنابراین آسیب DNA اسپرم یا ساختار کروماتین آن می تواند در هر مرحله از اسپرماتوژنز رخ دهد. آسیب DNA در اسپرماتوزوای بالغ می تواند به علت نقایصی در بسته بندی کروماتین باشد که از شکستگی های آندوژنی در DNA ناشی می شود یا ناشی از روند آپوپتوز قبل از انزال اسپر م ها باشد . به علاوه میزان بالای تولید ROS نیز می تواند منجر به آسیب DNA شود(Aitken & Krausz, 2001; Moustafa, et al., 2004; Zini & Libman, 2006). افزون بر این، فاکتورهای محیطی مانند سن، مصرف دارو و سیگار، فاکتورهای هورمونی وافزایش دمای بیضه ها و بیماری هایی مانند واریکوسل نیز از دیگر دلایل ایجاد آسیب در DNA اسپرم به شمار می روند(Gaur, Talekar, & Pathak, 2007; Ozmen, et al., 2007; Schmid, et al., 2007; Ståhl, et al., 2006).
1-7-1- بسته بندی غیرطبیعی کروماتین
ساختار کروماتین اسپرم برخلاف سلول های سوماتیک که ساختار هیستونی دارد از پروتئین های بیضه ای تشکیل شده است. در پستانداران 3 نوع از این پروتئین ها وجود دارد، پروتامین 1 که عمده ترین پروتئین اتصالی به DNA است، پروتامین 2 که فقط در برخی از گونه ها بیان می شود و پروتئین های انتقالی که هنگام جابه جایی هیستون با پروتامین به عنوان پروتئین های واسطه عمل می کنند . طی مرحله اسپرمیوژنز، در حدود 85 درصد این هیستون های بیضه ای توسط پروتامین ها جایگزین می شود و علت باقی ماندن 15 درصد هیستون ها، احتمالا به دلیل نقش ژن های موجود در این قسمت ها در لقاح، رشد اولیه جنینی و بیان یک سری از ژن ها از جمله ژن های اثرگذار (Imprinting) است(V.W. Aoki & D.T. Carrell, 2003; Carrell, Emery, & Hammoud, 2007; Tarozzi, Bizzaro, Flamigni, & Borini, 2007). همراه با جابجایی هیستون ها، پروتامین های غنی از آرژنین و سیستئین طی عبور از اپیدیدیم، گروه های سولفیدریل آزاد سریعاً اکسید شده و باعث تشکیل پیوندهای S-S دی سولفیدی می شود. وجود این پیوندها دلیل پایداری ساختار کروماتین است . همچنین وجود مولکول های Zn باعث به وجود آمدن پیوندهای غیرکووالان s….Zn….s می شود که این پیوندها نیز در افزایش پایداری ساختار کروماتین مؤثر هستند. پس از لقاح دوباره هیستون های موجود در ژنوم تخمک جایگزین پروتامین ها شده و فرایند متراکم شدن کروماتین خاتمه می یابد . در حقیقت نقص در محتوای میزان پروتامین در مردان نابارور بیانگر عدم متراکم شدن صحیح کروماتین برای روند لقاح طبیعی، مستعد شدن به آسیب DNA، تراکم زودرس کروماتین (PCC) بعد از انجام ICSI بوده و با عدم فعال شدن تخمک همراه است.