نگهداری و سانتریفیوژ

دانلود پایان نامه
بدین منظور در 9 فالکون در هر کدام 10 میلی لیتر از محیط کشت تهیه شده در مرحله قبل ریخته و به صورت زیر کشت میدهیم. در یکی از محیط کشتها چیزی کشت ندادیم و به عنوان نمونه شاهد قرار دادیم، در محیط کشت شماره یک 1/0 گرم از خاک باغچه ریختیم، درمحیط کشت شماره دو 1/0گرم خاک کمپوست، در محیط کشت شماره سه 1/0 گرم خاک باغچه ( پای درخت توت)، در محیط کشت شماره چهار 18/0 گرم از ناحیهی آلوده پوست سیب قرمز، درمحیط کشت شماره پنج 35/0گرم از ناحیهی آلودهی پوست سیبزرد، در محیط کشت شماره شش هم64/0گرم پوست گوجه آلوده، در محیط کشت هفت 59/0 گرم از پوست آلوده به میکروب سیب زرد و درمحیط کشت شماره هشت 14/0گرم از پوست آلودهی سیب زرد کشت دادیم. سپس نمونهها به مدت 3 تا 5 روز در شیکرانکوباتور با دمای 30 درجه وrpm 150 قرار داده شد [83].
بعد از رشد کردن اولیه نمونهها نیاز به غربالگری آنها در روی محیط کشت جامد میباشد. محیط کشت جامد حاوی ترکیبات زیر است:
03/0 گرم سدیمکلرید، 03/0 گرم آهننیترات، 03/0 گرم پتاسیمکلرید، 5/0 گرم آمونیومکلرید، 01/0 گرم آهنسولفات، 06/0 گرم پتاسیمدیهیدروژنفسفات، 02/0گرم منیزیمسولفات و 5/3 گرم آگار را در 100 میلی لیترآب حل کردیم. سپس pH محیط به 2/7 رسانده شد، به آن 4/0 گرم کوتین اضافه کردیم و محیط حاصل اتوکلاو گردید و بین پلیت ها تقسیم گردید. 20میکرولیتر از هر محیط کشت مایع را در زیر هود در هر پلیت تلقیح کرده و بعد به انکوباتور 30 درجه منتقل گردیده شد.
به دلیل اینکه نمونههای کشت داده شده و رشد کرده خالص نبودند، برای تخلیص نمونهها، کلنیهای رشد کرده به پتریهای دیگر حاوی محیط کشت انتقال دادیم. بعد از رشد مناسب سویهها، پلیتهای موردنظر تا زمان ساخت اسلنت در یخچال 4 درجه نگهداری می شود. سپس هر سویه را به یک slant برای نگهداری به یک محیط کشت مایع برای سنجش فعالیت کوتیناز انتقال دادیم. بعد از رشد نمونهها یک تک کلنی را برداشته و در محیط کشت مایع درون فالکون تلقیح داده شد و به مدت 3 تا 4 روز درون انکوباتور شیکردار با دور 150 دور در دقیقه و دمای 30 درجه سانتیگراد تیمار گردید. 4 گرم نوترینت اگار را در 200 میلی لیتر اب حل میکنیم اتوکلاو میکنیم سپس بین پتریها تقسیم میکنیم و سپس باکتریها را انتقال میدهیم. از این پتریها نمونهها را به اسلند انتقال میدهیم.
تهیه slant از سویههای جدا شده
یک کلنی خاص از سویههای جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنتها به مدت 48 ساعت، آنها در یخچال و دمای 4 درجه نگهداری میشوند. اسلنتها را هم به مدت 48 ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. 150 میلیلیتر آب را و 3 گرم نوترینت اگار را در بشر با حرارت ملایم حل میکنیم و در هر لوله 15 میلیلیتر میریزیم بعد پنبه میگذاریم و اتوکلاو میکنیم بعد به صورت کج میگذاریم تا ببندد و بعد از بستن و سرد شدن و یک کلنی خاص از سویههای جداشده را بر روی محیط اسلنت انتقال داده و بعد از انکوباسیون اسلنتها به مدت 48 ساعت، آنها در یخچال و دمای 4 درجه نگهداری میشوند. Slant ها را هم به مدت 48 ساعت (تا زمانی که رشد کنند) در انکوباتور قرار دادیم. (slant به مدت یک ماه قابل نگهداری است).
نگهداری طولانی مدت سویهها
به منظور نگهداری طولانی مدت سویهها، ابتدا محیط کشت مایع نوترینت براس یا LB تهیه نموده و سویهها را در آن تلقیح کرده و در شیکر انکوباتور به مدت 24 ساعت به منظور رشد بهینه قرار داده میشود سپس 760 میکرولیتر از محیط کشت حاوی باکتری و 760 میکرولیتراز گلیسرول 40% به میکروتیوبهای 5/1 میلی لیتری انتقال داده و به مدت چند دقیقه به آرامی تکان داده میشود و در فریزر80- برای طولانی مدت نگهداری میشود.
تهیه گلیسرول
200 میکرولیتر گلیسرول و 800 میکرولیتر آب مقطر را بهم افزوده و گلیسرول 20% تهیه می شود.
تهیه محیط کشتLB
5 گرم y(مخمر)
10 گرم T(تریپتون)
5 گرم nacl
این سه ماده را به هم اضافه نموده و آب مقطر به حجم یک لیتر اضافه میشود و اتوکلاو میشود.
محیط کشت LB را بعد از اتوکلاو در هر فالکون 5 میلیلیتر میریزیم و نمونه را به آن انتقال میدهیم. سپس به مدت 12 تا 24 ساعت در انکوباتور میگذاریم. بعد فالکونهای حاوی محیط کشت LB و نمونه را با rpm 4000 و به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ میکنیم.
2 میلیلیتر از محلول رویی را بیرون میریزیم و 3 میلیلیتر باقی مانده را پیپتاژ میکنیم. بعد درون هر ویال 600 میکرولیتر از محلول پیپتاژ شده و 400 میکرولیتر محلول گلیسرول 50 درصد میریزیم و به مدت چند دقیقه به آرامی تکان داده می شود بعد در یخچال 80- درجه نگهداری میکنیم.
Assay آنزیمی
به منظور assay یا سنجش فعالیت آنزیمی از تکنیک طیفسنجی یا روش اسپکتروفتومتری استفاده میشود. سیستم اسپکتروفتومتر نور ثابت با طول موج دلخواه به وجود میآورد. پس از عبور نور از محلول، نور باقیمانده به قسمت نورسنجی یا فوتومتر میرود. فوتومتر از نوع فتومولتی پلایر تیوب، فوتو دیود و… نور را به سیگنال الکتریکی تبدیل میکند. سپس سیگنالهای دریافت شده اندازهگیری و پردازش میشوند تا کمیت مورد نظر به دست آید. خروجی اسپکتروفوتومتر همیشه نموداری از شدت نور نسبت به طول موج است. دادههایی که برای تولید نمودار گردآوری شده، در جدولی از شدت نور و طول موج ذخیره میشود. مقدار گراف بیان کننده مقدار عبور یا مقدار جذب است. اسپکتروفوتومترهای امروزی دیجیتالی بوده و به وسیله میکروپروسور کنترل میشوند. از این دستگاه برای اندازهگیری غلظت ماده رنگی محلولها، به طور مثال اندازهگیری قند، اسید اوریک، کلسترول، آنزیمهای مختلف و… استفاده میشود. این دستگاه قابلیت اندازهگیری نمونههای فوق العاده کوچک را داشته لذا از آن برای تجزیه و تحلیل عناصر مولکول های RNA، استفاده میشود.
برای سنجش فعالیت آنزیم 60 میکرولیتر از گلیسرول حاوی نمونه از یخچال 80- برمیداریم و به 5 میلی لیتر از محیط LB انتقال می دهیم. این محیط را به مدت یک روز در شیکر انکوباتور می گذاریم. سپس 1000 میکرولیتر از هر محیط LB برمیداریم در 15 میلی لیتر از محیط کشت اولیه حاوی کوتین در هر فالکون میریزیم ودر شیکر انکوباتور قرار میدهیم و بعد از رشد نمونه ها، در 405 نانومتر اسپکت میگیریم.
برای assay باید دو بافر تهیه میکنیم:
بافر یک: 017/0 گرم KH2PO4 (merk5/99%)در 5 میلی لیتر آب حل میکنیم ( بافر فسفات) بعد pH را در ناحیهی 5/7 تنظیم میکنیم. سپس 5/2میکرولیتر تریتونX_100 اضافه میکنیم.
بافر دو: 017/0گرمKH2PO4 (merk5/99%) در 5 میلی لیتر آب حل میکنیم ( بافر فسفات) بعد pH را در ناحیهی 5/7 تنظیم میکنیم. سپس 25 میکرولیتر تریتونX_100 و 8 میکرولیتر PNPBاضافه میکنیم.
فالکونهای حاوی نمونه را 9000 دور به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ میکنیم.