نگهداری و سانتریفیوژ

دانلود پایان نامه

g/mol
Merck
مراحل استخراج DNA با استفاده از روش CTAB
1- ابتدا محیط کشت مایع نوترینت براس تهیه شده و سویهها را در آن تلقیح نموده و در شیکر انکوباتور با 100rpm و دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت قرار داده تا باکتریها به میزان کافی رشد نمایند.
2- سپس 5/1 میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری را در میکروتیوب ریخته و با 10000rpm به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ میشود( این مرحله 3 بار تکرار می شود).
3- مایع رویی را دور ریخته و پلیت مشاهده میگردد.
4- به پلیت مشاهده شده ته میکروتیوب، 560 میکرولیتر بافرTE افزوده و چندبار به آرامی تکان داده می شود.
5- 30 میکرولیتر SDS 10% و همچنین 3 میکرولیتر پروتئینازK mg/ml200 را به آن اضافه نموده که به غلظت نهایی g/mlµ100 برسد و دوباره آن را خوب هم زده ودر حمام آب گرم به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه گذاشته و هر 10 دقیقه یک بار هم زده میشود.
6- 100 میکرولیتراز NaCl 5 M به آن افزوده و دوباره به آرامی تکان داده میشود.
7- 80 میکرولیتر CTAB/NaCl به آن اضافه نموده و سپس به مدت 5 دقیقه تکان داده و در حمام آبگرم 65 درجه به مدت 10 دقیقه قرار داده میشود.
8- پس از خروج از حمام آبگرم 7/0 (کلروفرم : ایزوآمیل الکل به نسبت 24:1 ) به آن افزوده و خوب تکان داده و سپس سانتریفوژ به مدت 5 دقیقه و rpm 10000 در دمای اتاق انجام میشود.
9- بجای مرحله فنول مرحله کلروفرم را دوبار تکرار کرده و بار دوم هم حجم سوپرناتانت، کلروفرم : ایزوآمیل الکل اضافه گردید.
10- بعد از سانتریفوژ 3 فاز در میکروتیوب دیده میشودکه بایستی مایع رویی را به آرامی برداشته و به میکروتیوب جدید منتقل میشود.
11- 6/0 حجم سوپرناتانت به آن ایزوپروپانول سرد افزوده و سپس چند دقیقه تکان داده و در فریزر20- به مدت حداقل نیم ساعت نگهداری میشود.
12- پس از خروج از فریزر آن را سانتریفوژ نموده ومایع رویی دور ریخته میشود.
13- به پلیت شیری رنگ مشاهده شده ته میکروتیوب ، 400میکرولیتر الکل 70% اضافه نموده و سپس سانتریفوژ میشود.
14- مایع رویی دور ریخته میشود و سپس تیوب ها را روی کاغذ صافی تمیز گذاشته شده تا کاملا خشک شوند.
15- در مرحله آخر و پس از خشک شدن تیوب ها ، به هر تیوب50 میکرو لیتر آب آمپولی یا 200 میکرولیتر TE اضافه میشود. سپس چند دقیقه در دمای اتاق گذاشته که پلت در آن بخوبی حل شود و سپس به فریزر20- منتقل میکنیم و برای مرحله PCR مورد استفاده قرار میگیرد.
روش استخراج DNA با کیت
1000 میکرولیتر بافر G2 را به 200 میکرولیتر از نمونه باکتری رشدکرده اضافه میکنیم سپس 3/0 گرم از zirconia 1/0 میلی متر به مخلوط اضافه شده و پس از ان به مدت 5 دقیقه تیوب را ورتکس میکنیم.
20 دقیقه در دمای 70 درجه انکوبه میکنیم و هر پنج دقیقه یکبار تکان میدهیم سپس 5 دقیقه دور 13000 سانترفیوژ میکنیم بعد فاز رویی را به یک تیوب جدید انتقال میدهیم.
300 میکرولیتر بافر G3 را به پلت مرحلهی قبل اضافه میکنیم و بعد مرحلهی2 را تکرار میکنیم و فاز رویی را به یک میکروتیوب جدید اضافه میکنیم سپس هر دو تیوبی را که دارای فاز رویی میباشند را به یک میکروتیوب جدید منتقل میکنیم.
نسبت 1 به 5 بافر G3 به سوپرناتانت مرحلهی قبل اضافه میکنیم 5 دقیقه روی یخ انکوبه میکنیم سپس ده دقیقه 13000 دور سانتریفیوژ میکنیم و بعد سوپرناتانت را به یک تیوب جدید اضافه میکنیم و بعد به همان نسبت ایزوپروپانول اضافه میکنیم تکان میدهیم و روی یخ به مدت 30 دقیقه انکوبه میکنیم.
15 دقیقه 13000 دور سانتریفیوژ میکنیم و سوپرناتانت ها را دور می ریزیم و پلت ها را با 1 میلی لیتر اتانول 70 درصد شست و شو میدهیم و سپس پلت را در 200 میکرولیتر بافرDG1 حل می کنیم.