نگهداری و سانتریفیوژ

دانلود پایان نامه

2 میکرولیترRNase A را به تیوب اضافه می کنیم و در 37 درجه برای 15 دقیقه انکوبه می کنیم و سپس 20 میکرولیتر پروتئینازK اضافه می کنیم هم میزنیم و بعد 200 میکرولیتر DG2 اضافه کرده و هم می زنیم.
برای 20 دقیقه در 60 درجه انکوبه کرده و 200 میکرولیتر اتانول به ان اضافه می کنیم و مدت زمان کمی هم می زنیم.
محلول را به ستون اسپین موجود در کیت اضافه می کنیم.
یک دقیقه 10000 دور سانتریفیوژ می کنیم و محتویات پایین ستون را دور می ریزیم.
اضافه کردن 500 میکرولیتر بافر DG3 به ستون و 10000 دور برای یک دقیقه سانتریفیوژ می کنیم و محتویات پایین ستون را دور می ریزیم.
700 میکرولیتر بافرDG4 به ستون اضافه کرده و یک دقیقه با دور 8000 سانتریفیوژ می کنیم و محتویات پایین ستون را دور می ریزیم.
سه دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ می کنیم ستون را برمیداریم و در یک تیوب 5/1 میلی لیتری جدید می گذاریم.
100 میکرولیتر بافر DG5 به ستون اضافه کرده دو دقیقه در دمای اتاق قرار می دهیم و یک دقیقه با دور 10000 سانتریفیوژ می کنیم.
محلول جمع شده در تیوب را دوباره به ستون اضافه می کنیم و دو دقیقه در دمای اتاق می گذاریم و دو دقیقه با دور 13000 سانتریفیوژ می کنیم.
فاز زیری برمیداریم و در یخچال 20- نگهداری می کنیم.
اندازهگیری کیفیت و غلظت DNA
بعد از تهیه DNA لازم است که کیفیت استخراج توسط ژل و طیف سنجی مورد بررسی قرار گیرد.
کنترل کیفیت و کمیت DNA به شرح زیر میباشد.
الف) اندازهگیری غلظت DNA توسط اسپکتروفتومتری
برای تعیین کمیت و کیفیت DNA از دستگاه اسپکتوفتومتر استفاده میشود. در این دستگاه از دو طول موج 260 و280 نانومتر استفاده می‌شود. ظرفیت کوئت مورد استفاده 500 میکرولیتر است. قبل از عمل اندازه‌گیری غلظت DNA باید دستگاه کالیبره شود. برای کالیبر دستگاه از 500 میکرولیتر TE استفاده شد. این عمل به این نحو انجام شد که ابتدا کوئت سه بار با آب مقطر شستشو داده شد. سپس 500 میکرولیتر TE به آن اضافه شده و در دستگاه قرار داده شد. با فشردن کلید کالیبرکردن، مقادیر 260A و280A روی صفر تنظیم شدند. در این آزمایش پس از کالیبرکردن، کوئت خالی شده و سپس به آن 495 میکرولیتر TE اضافه شد. سپس 5 میکرولیتر از نمونه‌های DNA که اخیراً (حدوداً 24 ساعت قبل) استخراج شده‌اند و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد بوده‌اند، به آن اضافه گردیدند. چنانچه مشخص است با این عمل غلظت DNA، 42 بار رقیق‌تر می‌شود که بعداً برای محاسبه غلظت DNA اصلی باید آن را منظور کرد. پس از اضافه‌کردن DNA به کوئت آن را در دستگاه قرار داده و مقدار جذب ثبت گردید. بیشترین مقدار جذب امواج توسط DNA در طول موج 260 نانومتر اتفاق می‌افتد. از طرفی مقدار بالای جذب در 280 نانومتر نشانه وجود موادی غیر از DNA در نمونه است. بنابراین مقدار عددی جذب در 260 نانومتر معیاری از غلظت DNA و نسبت عددی دو مقدار جذب در 260 به 280 معیاری از کیفیت آن است. در این آزمایش نمونه‌های DNA که دارای نسبت جذبی نزدیک به 8/1 هستند برای انجام آزمایش نگهداری شدند زیرا از کیفیت مناسبی برای PCR برخوردار هستند. برای تعیین غلظت DNA از فرمول 50 × df × 260 A =غلظت DNA (به نانوگرم در میکرولیتر) و 50 × 100 × 260 A= غلظت DNA (به نانوگرم در میکرولیتر) استفاده گردید.
چنانچه ذکر شد در این آزمایش df یا ضریب رقت برابربا 42 بود. عدد 50 نیز در فرمول به این خاطر نوشته شده که اگر جذب در 260 نانو متر برابر با 1 باشد تقریباً معادل غلظت 50 نانوگرم DNA در میکرولیتر است. . بعد از این مرحله طبق فرمول مذکور غلظت تمام نمونه‌ها بر حسب نانوگرم در میکرولیتر مشخص شود. به دلیل اینکه در واکنش PCR از DNA با غلظت 25 نانوگرم استفاده می‌شود، برای هر نمونه مقدار 100 میکرولیتر DNA با غلظت 25 نانوگرم تهیه شود. عمل رقیق کردن با آب دوبار تقطیر انجام گیرد (یا محلول TE). نمونه‌های 25 نانوگرمی در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شده و نمونه‌های DNA اصلی به دمای 20- درجه منتقل شود.
برای یکسان کردن غلظت نمونههای موجود به 25 نانوگرم، از فرمول C1V1=C2V2 استفاده شده است.
C1 = غلظت DNA در محلول پایه
C2 = میزان DNA در محلول مورد استفاده
V1= حجم محلول پایه که بایستی برداشته شود
V2= حجم کل محلولی که بایستی تهیه شود
برای اینکه مشخص شود DNA سالم بوده و شکستگی ندارد مقدار بسیار کمی از آن بر روی ژل آگارز 1% الکتروفورز شود. در نهایت DNA هایی انتخاب میشود که نه تنها نتایج حاصل از اسپکتوفتومتری آنها مناسب بوده بلکه بر روی ژل آگارز نیز تنها تشکیل یک باند پررنگ در بالای ژل بدهند.
ب) اندازهگیری کیفیت DNA توسط ژل آگارز
الکتروفورز به عنوان روش اصلی در جداسازی و مشاهده مستقیم قطعه های اسید نوکلئیک به کار گرفته می شود. اساس این روش بر این واقعیت بنا شده است که در pH خنثی اسیدهای نوکلئیک ترکیباتی پلی آنیونی بوده، چرا که حاوی تعداد زیادی گروه فسفات با بار منفی در اسکلت قند- فسفات می باشند. این بدان معنی است که اگر در یک میدان الکتریکی قرار بگیرند به سمت قطب مثبت حرکت می کنند. الکتروفورز با قرار دادن نمونه روی ژل و ایجاد اختلاف پتانسیل در طول ژل انجام می گیرد. سرعت حرکت قطعات سبکتر نسبت به قطعات سنگین تر بیشتر بوده و به همین دلیل قطعات مختلف DNA از هم جدا شده و نوارهای مختلفی را تشکیل می دهند. برای تفکیک محصولات PCR که در واقع قطعات DNA تکثیر شده است، از الکتروفورز افقی به وسیله ژل آگارز 1درصد استفاده میشود.