نگهداری و مقایسه

دانلود پایان نامه
ابتدا غلطت نمونه شسته شده به 20 میلیون رسانده و اسمیر تهیه می شود. پس از خشک شدن اسمیر ها در دمای اتاق مراحل زیر به ترتیب انجام می شود :
1-فیکس کردن اسمیرها : الف)پارافرمالدهید 4% در PBS با PH=7.4 (بمدت 20 دقیقه در دمای 15 تا 25 سانتیگراد).
ب) یا در متانول 100% بمدت 4 دقیقه (نگهداری طولانی مدت در فریزر).
2-لام های فیکس شده در جا لامی گذاشته و آنها به مدت 30 دقیقه در محلول (×1) PBS که از قبل تهیه شده قرار داده می شود. نقش PBS شستشوی نمونه می باشد.
3-انکوباسیون با محلول blocking ( H2O2 3% در متانول) بمدت 10 دقیقه در دمای 15 تا 25 سانتی گراد صورت می گیرد.
4-سپس با PBS به مدت 5 دقیقه شستشو داده می شود.
5-انکوباسیون با محلول تریتون 1/0 درصد در سدیم سیترات 1/0 درصد این محلول باید به صورت تازه ساخته شود و روی یخ بمدت 2 دقیقه در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد صورت می گیرد ، تریتون باعث نفوذ پذیری غشای سلول ها می شود.
6- سپس با PBS به مدت 5 دقیقه شستشو داده می شود.
7-محلول TUNEL بمدت 1 ساعت در محیط تاریک، مرطوب و دمای 37 درجه قرار داده می شود. این محلول طبق پروتکل کیت مصرفی تهیه می شود به این صورت که کیت را که در فریزر نگهداری می شود را بیرون آورده می شود و به مدت یک الی دو دقیقه در محیط گذاشته تا از حالت یخ به صورت مایع تبدیل شود. بعد برای هر لام، 5 میکرو لیتر محلول آنزیم و 45 میکرو لیتر محلول لیبل درون یک میکروتیوپ با هم مخلوط می شود و به تمام قسمت های لام ریخته می شود. ظرف مستطیل شکل بزرگی برداشته، دو میله به صورت موازی در آن گذاشته می شود و لام ها روی میله ها چیده می شود، کمی آب مقطر ته ظرف ریخته می شود تا مرطوب بماند، پس از گذاشتن در ظرف، ظرف به مدت یک ساعت درون انکوباتور قرار داده می شود تا واکنش های مربوطه صورت گیرد.
8- سه مرتبه به وسیله ی PBS، هر مرتبه به مدت 5 دقیقه شستشو داده می شود.
9-سپس انکوباسیون با converter – probe بمدت 30 دقیقه در انکوباتور 37 درجه صورت می گیرد.
10- با محلول(4.5 µl substrate (H2O2) + 500µl DAB) DAB بمدت20 دقیقه در محیط تاریک، مرطوب و دمای 37 درجه انکوبه می شود.
11-دوباره عمل شستشو با PBS انجام می شود.
12- به وسیله ی رنگ هماتوکسیلین به مدت 3 دقیقه رنگ آمیزی می شود.
13- آبگیری در الکل های 25، 50، 75 و 100 درصد هر کدام 5 دقیقه صورت می گیرد.
14-شفاف سازی لام ها به وسیله ی زایلن و چسباندن توسط چسب انتلان انجام می شود.
15-سپس با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X100 مشاهده می شود و تعداد 100 اسپرم شمارش می شود.
سلولهای با رنگ قهوه ای تیره دارای شکستگی DNA می باشد و TUNEL+در نظر گرفته شد.
2-3-6- آنالیز آماری
برای آنالیز آماری نرم افراز SPSS 15 مورد استفاده قرار گرفت. از آزمون T test – Independent Sample برای مقایسه پارامترهای سیمن قبل و بعد از شستشو استفاده شد. از تست ANOVA یک طرفه با تست تکمیلی Tukey برای مقایسه آسیب به DNA اسپرم بین گروه های مختلف استفاده شد. جهت بررسی بین زمان انکوباسیون و آسیب DNA اسپرم آزمون Pearson خطی مورد استفاده قرارگرفت. فرضیه ما دو دامنه بوده است. سطح معنا داری برای P value کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.
فصل سوم
نتایج
3-1- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم
در زمان قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت سریع اسپرم 57/2±48/20 بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت سریع اسپرم به 27/3±52/42 افزایش یافت.