چگونگی تنظیم و بهینه سازی

دانلود پایان نامه

آنزیم
آنزیمها مولکولهای‌ پروتئینی‌ بزرگی‌ هستند که‌ به‌ شکل کاتالیزور در‌ واکنشهای‌ وابسته‌ به‌ هم در‌ داخل‌ ‌ سلول‌ زنده ‌دخالت‌ میکنند. در ساختمان‌ بعضی‌ از آنزیم ها مواد غیر پروتئینی‌ به‌ نام‌ گروه‌ پروستتیک شرکت‌ دارند. برای‌ هر فعل‌ و انفعال‌ شیمیایی‌ که‌ در یک‌ سلول‌ رخ‌ می‌دهد آنزیم‌ ویژه‌ای‌ وجود دارد که ‌کاتالیزور آن‌ واکنش‌ به‌ حساب‌ می‌آید. تولید هر آنزیم‌ بخصوص‌ بوسیله‌ یک‌ یا چند ژن‌ موجود در مواد ژنتیکی‌ کنترل‌ می‌شود اما آخرین‌ مراحل‌ تولید آنها بوسیله‌ m-RNA و ریبوزوم ‌ها با کمک‌ مولکولهای‌ آنزیم‌ ویژه‌ و مناسب‌ انجام ‌میگیرد. آنزیمها به‌ عنوان‌ کاتالیزور در واکنشهای‌ مربوط به‌ تبدیل‌ یک‌ مولکول‌ به‌ مولکول‌ دیگر از طریق‌ تغییر محل‌ دادن ‌یک‌ اتم‌ و یا یک‌ رادیکال‌ نقش‌ مهمی‌ را بازی‌ می‌کنند.
آنزیمها میتوانند تا یک میلیون بار سرعت واکنشها را زیاد کنند. این واکنش ها از لحاظ نظری برگشت پذیرند و باید به تعادل برسند. آنزیمها واکنشها را در جهت چپ و راست به طور یکسان تحت تاثیر قرار میدهند به طوری که حالت پایدار تغییر نکرده ولی سرعت واکنش زیاد میشود. هر سلول زنده حاوی صدها آنزیم است و فقط در صورتی می تواند عملکرد مفیدی داشته باشد که این عمل به طور مناسبی هدایت شود.
انواع‌ آنزیم ها بر اساس‌ عملکردشان‌ به شش گروه تقسیم میشوند:
اکسیدوریداکتازها: آنزیم‌های‌ شرکت‌ کننده‌ در واکنشهای‌ اکسیداسیون‌ و احیا‌ بوده‌ و درانتقال‌ الکترون‌ از ماده‌ اکسید شونده‌ به‌ ماده‌ احیا شونده‌ نقش‌ دارند.
هیدرولازها: آنزیمهایی‌ که‌ با افزودن‌ یک‌ مولکول‌ آب‌ اتصالهای‌ استری‌، گلوکوزیدی‌ و… را می‌شکنند.
لیازها: آنزیمهایی‌ که‌ با شکستن‌ باندهای‌ C-N یا C-O یا C-C عمل‌ تجزیه کنندگی‌ دارند.
ترانسفرازها: آنزیمهایی‌ که‌ با انتقال‌ یک‌ گروه‌ از یک‌ مولکول‌ به‌ مولکول‌ دیگر عمل‌ کاتالیزوری‌ خود را انجام‌ می‌دهند.
ایزومرازها: آنزیمهایی‌ که‌ عمل‌ تغییر محل گروهها را در داخل‌ یک‌ مولکول‌ انجام‌ می‌دهند.
لیگازها : آنزیم‌هایی‌ که‌ با کمک‌ انرژی‌ آزاد شده‌ در نتیجه‌ شکستن‌ باند فسفات های‌ پر انرژی‌، اتصال‌ دو مولکول‌ را انجام‌ می‌دهند.
در بین‌ آنزیمهای‌ فوق‌ الذکر، هیدرولازهایی مانند کوتیناز، مهمترین‌ آنزیمهایی‌ هستند که‌ در ایجاد بیماری‌ به‌ وسیله‌ آفات‌ گیاهی ‌شرکت‌ دارند، این آنزیم کوتین را تجزیه میکند، کوتین نقش کلیدی در محافظت از گیاهان در برابر ورود پاتوژن های بیماریزا دارد و تخریب آنزیمی آن اولین گام در روند آلودگی است.
آنزیم کوتیناز
کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه میکند (شکل2-5)، کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلیاستری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافتهاند [13]. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و حاوی یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. باندهای استری در کوتین غالب هستند اگرچه پل های پراکسید و اتصالات اتری نیز مشاهده شده است.کوتین نقش کلیدی در محافظت از گیاهان در برابر ورود پاتوژن های بیماریزا دارد و تخریب آنزیمی آن اولین گام در روند آلودگی است.
شکل ‏25 a) توالی پروتئینی آنزیم کوتیناز b) مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز [14]
بسیاری از میکروارگانیسمها روی مواد پلیمری به عنوان تنها منبع کربن خود رشد میکنند [15]. استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسمها مستلزم ترشح آنزیمهای هیدرولازی است. اگرچه هنوز مشخص نیست که چگونه یک پلیمر می تواند وارد سلول شود و باعث تولید آنزیمهای هیدرولازی شود یک احتمال این است که میکروبها یک سطح پایه ای از چندین آنزیم هیدرولازی ترشح میکنند و سپس محصولات هیدرولیز شده وارد سلول میشوند وسنتز آنزیم ها را القا میکنند.
آنزیم کوتیناز از منابع مختلف (گرده [16] و به طور عمده قارچ [17]) تخلیص و جداسازی میشود. مدارک و شواهد نشان داده که کوتیناز توسط phyllospheric fluorescent Pseudomonas putida strain ، cohabiting با باکتری تثبیت کننده نیتروژن نیز تولید شده است [18].
حمله به گیاهان توسط قارچ phytopatogenic بر اساس ترشح کوتیناز خارج سلولی است و Ascochyta rabiei، عامل سوختگی Ascochyta در گیاه نخود یک کوتیناز خارج سلولی را ترشح میکند که حداکثر فعالیت را در حدود pH حدود 8 نشان می دهد [19]. مطالعات نشان میدهد که بیان کوتیناز از بوتری تیس در طول آلودگی برگ های گوجه فرنگی در مراحل اولیه الودگی کم است و هنگامی که قارچها در برگ ساکن شوند و شروع به اسپورزایی کنند بیان کوتیناز زیاد میشود[20] همچنین بیان این آنزیم در گل ژربرا و میوه گوجهفرنگی مورد مطالعه قرار گرفته است [21]. کوتیناز در جوانه زنی Erysiphe graminis f. sp. hordei conidia اهمیت داشته و به خصوص در تشکیل لوله جوانه مجاور و نفوذ به کوتیکول میزبان اهمیت ویژهای دارد [22].
مطالعات نشان داده است که می توان با استفاده از مهارکنندهها از نفوذ قارچها به گیاهان و در نتیجه از آلودگی جلوگیری کرد [23]. از انجایی که کوتیناز نقش مهمی در بیماریزایی دارد، مطالعات متعددی برای تعیین خواص فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی آن انجام شده است [24]. کوتینازها سرین هیدرولازهای خاصی برای استر الکل های اولیه هستند[24]. امروزه بیشترین مطالعات روی قارچ فوزاریوم نخودفرنگی انجام شده است [15]. تولید کوتیناز توسط بسیاری از شرایط رشد تنظیم میشود. تولید این آنزیم توسط گلوکز سرکوب میشود[25] و توسط کوتین هیدرولیز شده یا اجزای اصلی تشکیل دهنده آن 16-هیدروکسی هگزانوئیک اسید و 10,16 دی هیدروکسی هگزانوئیک اسید و 9,10,18- تری هیدروکسی پالمیتیک اسید القا می شود [26]. گروه هیدروکسیل در موقعیت امگا مهمترین عامل برای القای فعالیت است [24]. درک چگونگی تنظیم اسیدهای چرب هیدروکسی در بیان ژن کوتیناز به وسیله اطلاع از ساختار ژن کوتیناز و مناطق flanking تسهیل شد [27]. به منظور درک مولکولی این تنظیم ژن، عناصر عملکردی در پروموتور کوتیناز و فاکتورهای رونویسی متصل در این قسمتها مورد مطالعه قرار گرفته اند [25].
کلون و بیان کوتیناز
ساختار اولیه کوتیناز از cDNA کوتیناز جدا شده از قارچ Fusarium solani f. pisiتعیین شد [28]. آنالیز توالی کوتیناز نشان داد که mRNA کوتیناز شامل 1050 نوکلئوتید است. مطالعات دیگری هم از کلون ژن کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی در وکتور 35 انجام و گزارش شده است [29].
با توجه به اهمیت کاربردهای کوتیناز ، این آنزیم در میزبانهای هترولوگوس کلون و بیان شده است. کتابخانه cDNA قارچ فوزاریوم سولانی که حاوی ژن کوتیناز می باشد [30] بر مبنای کار Soliday و همکاران در سال 1984 ساخته شد. cDNA با کل ناحیه ی کدینگ کوتیناز به پلاسمیدpUC19 انتقال داده شد و تعیین توالی شد. ژن کلون شده بعد از سیگنال پپتید از آلکالین فسفاتاز به منظور هدایت کوتیناز به پری پلاسم E.coli بیان شد. فرض اولیه این بود که گلایسین در موقعیت 32 در محصول ترجمه اولیه کوتیناز متناسب با رزیدویN ترمینال کوتیناز نهایی است. تلفیقی از سیگنال phoA با گلیسین 32 منجر به ایجاد یک مکان پردازش غیرمعمول شد، بنابراین به منظور ایجاد یک سایت برشی احتمالی پروکاریوتی، 16 باقی ماندههای اولیه پری کوتیناز توسط سیگنال phoA جایگزین شد و همزمان Leu-17 به وسیله آلانین جایگزین شد. تلفیقی از توالیها برای phoA و کوتیناز توسط جهش الیگونوکلئوتیدی جهتدار تنها با استفاده از پلاسمید نوع pMa/c انجام شد. در نتیجه در وکتور pMa/c5-CUF، ژن phoA/cutinase تحت کنترل رونویسی پروموتور Ptac القاپذیر با IPTG قرار گرفت. سویه ی E. coli WK6 به عنوان اولین میزبان برای بیان استفاده شد. در این شرایط میزان بالایی از کوتیناز سنتز شد و با توجه به موقعیت پریپلاسمیک کوتیناز ساخته شده، از این طریق میزان زیادی از کوتیناز برای تعیین ساختار آن فراهم شد. کوتیناز نوترکیب میتوانست بهراحتی در مقادیر زیاد تولید و تخلیص شود [30].
اخیرا یک سیستم تولید موثر برای کوتیناز در قارچ فوزاریوم سولانی در ساکرومایسیس ایجاد شده که علت آن این است که مخمر قادر به انجام تغییرات پس از ترجمه است که برای فعالیت بیولوژیکی پروتئین کامل مهم است همچنین جهشهای نقطه ای برای بهینه سازی فعالیت لیپازی در ژن کوتیناز مطرح شده است [31]. پپتید سیگنال اولیه کوتیناز به وسیله پپتید مخمر β-D-fructofuranosidase جایگزین شد و ژن در پلاسمید MIRY دارای پروموتور Pgal7 کلون شد [32]. این پلاسمید شامل تعداد کپی بالایی (100 تا 200 در هر سلول) با ثبات میتوزی بالا تحت شرایط غیر انتخابی است [33]. نمونههای ترانسفورم شده در طی 5 روز بدست آمدند و در محیط کشت fed-batch که دارای میزان بالایی از کوتیناز خارج سلولی در محیط کشت تخمیری شده بود رشد کردند [32]. مطالعات دیگری نیز بر روی گونه های اسپرژیلوس و سرویزیه حامل دیگر پلاسمیدها نیز گزارش شده است. یک کپی از cDNA کوتیناز قارچ فوزاریوم سولانی که با الیگونوکلوئوتیدی سنتزی شروع میشود ساخته شده است. توالی یابی ژن کوتیناز دنبال شد با کلونینگ این ژن در پلاسمیدpUC9 که منجر به بدست آمدن این پلاسمید ناقل کوتیناز از ساکارومیسز سرویزیه SU50 و Aspergillus awamori شد [34].
همچنین بازده ترشح کوتیناز گونه طبیعی (CY000) و گونه جهش یافته آبگریز (CY028) به وسیله ساکارومیسز سرویزیه SU50 مقایسه شدند. سویه CY000 قادر است تا 25 میلی گرم کوتیناز در گرم (وزن خشک) را ترشح کند در حالی که سویه CY028 فقط قادر به ترشح 2 میلی گرم در گرم میباشد [35].
از برخی گونه های اسپرژیلوس ژاپونیکا نیز به عنوان سلول میزبان استفاده شدهاند، که این حاوی یک توالی DNA نوترکیب است که کد کننده کوتینازی است که با پروموتور قارچی پیوند یافته است. مشتقات سنتزی cDNA کوتیناز در Aspergillus awamori AW4-20 با استفاده از ژن پروموتور و ترمیناتور (Awamori endoxylanase II (ex1A بیان شدهاند. اتصال ژن کوتیناز به پروموتور endoxylanase II با چهار نوع توالی متفاوت از الیگونوکلئوتید های سنتزی ساخته شده است. گونه های دارای چند کپی نسبت به گونههای دارای تک کپی از پلاسمید، افزایش 6 تا 12 برابری ترشح کوتیناز خارج سلولی را نشان میدهد [34, 36].